ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 1, с. 135-142
ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ
УДК 581.1
ВЫДЕЛЕНИЕ, МУТАГЕНЕЗ И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММОВ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОДИЗЕЛЯ © 2014 г. Б. К. Заядан*, С. Пуртон**, А. К. Садвакасова*, А. А. Усербаева*, К. Болатхан*
*Казахский национальный университет им. аль-Фараби, Алматы, Казахстан **Лондонский колледж-университет, Лондон, Великобритания Поступила в редакцию 29.10.2012 г.
Выделены альгологически чистые культуры микроводорослей из различных водных экосистем, которые идентифицированы как представители зеленых водорослей, эвгленовых водорослей, ци-анобактерий. Проведен скрининг по продуктивности выделенных культур и коллекционных штаммов микроводорослей. Методом индуцированного мутагенеза (УФ-облучение, 254 нм, 40 эрг/мм2) и селекции получен мутантный штамм Chlorellapyrenoidosa C-2m2, характеризующийся высокой активностью биосинтеза и накопления липидов, и проведена оптимизация условий его культивирования. Установлено, что оптимальными условиями для интенсивного накопления липидов клетками C. pyrenoidosa C-2m2 является уменьшение концентрации азота в питательной среде в 10 раз (до 0.004 г/л) и освещенность на уровне 4 клк.
Ключевые слова: Chlorella pyrenoidosa — микроводоросли - автоселекция — продуктивность — продуценты топливного масла — биодизель
Б01: 10.7868/80015330314010187
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время истощение мирового запаса нефти и загрязнение планеты отходами ее использования обусловили привлекательность производства биодизеля — экологически чистого топлива на основе возобновляемых биоресурсов. В качестве решения проблемы нефтяного кризиса за счет производства биодизельного топлива большинство развитых стран рассматривают возможность выращивания большего количества масличных культур. Но необходимо учесть, что чем больше сельскохозяйственных площадей будет отводиться под технические культуры, тем стремительнее начнут расти цены на продукты питания.
Водоросли тоже синтезируют масло, которое могло бы стать сырьем для производства биодизельного топлива. Они способны накапливать огромное количество липидов - до 50% собственного веса. Учитывая, как быстро растут микроводоросли и какие площади способны они занимать,
Сокращение: Nile Red - реактив Нильский красный. Адрес для корреспонденции: Заядан Болатхан Казиханович. Казахстан, 050040 Алматы, пр. аль-Фараби, 71. Казахский национальный университет им. аль-Фараби, факультет биологии и биотехнологии. Электронная почта: bolatkhan@kaznu.kz
эти организмы рассматриваются как важный продукт для энергетической промышленности. Некоторые их виды могут вырабатывать в 10-20 раз больше потенциального биотоплива, чем рапс или подсолнечник [1-3], и при этом водоросли являются прекрасным самовозобновляемым сырьем.
Целью данной работы было получение штаммов микроводорослей, способных накапливать липиды, и оптимизация технологии их культивирования для производства биодизеля.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы штаммы микроводорослей из коллекции лаборатории биотехнологии КазНУ им. аль-Фараби: Chlorella pyrenoidosa C-2, Scenedesmus obliquus Z-2; микроводоросли, выделенные из природных экосистем: Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, Chlorella sp., Chlamy-domonas reinhardtii, Spirulina platensis, Dunaliella salina и полученные методом индуцированного мутагенеза штаммы — C. pyrenoidosa C-1m и C. pyrenoidosa C-2m.
Перед началом экспериментальной работы провели адаптацию исследуемых культур к условиям выращивания. В результате нескольких пересевов на жидкую питательную среду [4] получили их синхронные культуры.
Для получения мутантных штаммов методом индуцированного мутагенеза использовали УФ-А свет с длиной волны 254 нм и мощностью 40 эрг/мм2. Для учета выживаемости и количества мутаций на поверхность питательных сред [4] в чашки Петри высевали определенное количество клеток из расчета 500-1000 клеток на чашку. Посеянный на чашки материал инкубировали в лю-миностате. Через 7-10 суток под бинокулярной лупой МБС-2 (ОАО "ЛЗОС", Россия) при увеличении 7 х 2 определяли количество выживших колоний хлореллы и учитывали долю мутантных клонов по размеру, морфологическим признакам и цвету колоний.
При изучении динамики роста клеток хлореллы на твердой среде после воздействия на культуру различных мутагенных факторов использовали метод микроколоний, который позволяет изучить картину поражения клеток и на основе этого определить их выживаемость при различных дозах действующих факторов. Для этого суспензию клеток высевали широкими штрихами на твердую питательную среду 04 [4] в чашках Петри (состав среды приведен ниже). Штрихи подсушивали, чашки Петри выставляли на свет. Затем через разные промежутки времени клетки исследовали под микроскопом при увеличении 20х или 40х. Для определения процента клеток, образующих нормальные по жизнеспособности колонии, обычно проводили учет 300-400 микроколоний, включая пораженные клетки.
С целью проведения автоселекии культуры микроводорослей их выращивали на среде 04 (г/л): (NH4)2SO4 - 0.2; K2HPO4 - 0.03; CaSO4 х 7 H2O -0.03; NaHCO3 - 0.1; KCl - 0.025; FeCl3 - 0.15 мл 1% раствора; почвенный экстракт - 0.5 мл; микроэлементы по Тамия [5]; экстракт куриного помета — 10 мл. Культуру выращивали при непрерывном освещении 3 клк и температуре 25-28°С в течение 36 суток. Исходная концентрация клеток — 1 х 106 кл./мл.
Продуктивность исследуемых культур определяли по коэффициенту скорости роста, динамике скорости роста и выходу сухой биомассы. Коэффициент скорости роста микроводорослей определяли на третий—четвертый день интенсивного культивирования и рассчитывали по приросту численности клеток в экспериментальных сосудах по уравнению:
к = 1/t х lnNt/N0,
где N0 — исходная численность клеток; Nt — численность клеток через время t.
Контроль за числом клеток микроводорослей в культуре осуществляли с помощью камеры Го-ряева. Загущенную суспензию микроводорослей получали путем ее промывания дистиллированной водой для удаления солей с последующим
центрифугированием. Пасту водорослей высушивали до воздушно-сухого состояния в сушильном шкафу при 45° С.
Для определения липидов брали навеску 15— 20 мг, экстрагировали смесью хлороформ : метанол (2 : 1, объем 0.1—0.2 мл) и упаривали ее на кипящей водяной бане. Затем добавляли 0.2 мл серной кислоты и выдерживали на бане 10 мин. Пробирки с пробами охлаждали, прибавляли 1 мл фосфованилинового реактива, тщательно перемешивали и оставляли на кипящей водяной бане еще на 15 мин. После этого содержимое пробирок вновь охлаждали и калориметрировали на приборе КФК-3 (ОАО "Загорский оптико-механический завод", Россия) при 540 нм и длине оптического пути l см. Контролем служила "холостая проба" — все реактивы без экстракта. Содержание липидов рассчитывали по калибровочному графику.
Кроме этого, анализировали накопление липидов у мутантного штамма C. pyrenoidosa C-2m флуоресцентным методом с помощью реактива Нильского красного (Nile Red). Суспензию культуры мутантного штамма C. pyrenoidosa C-2m окрашивали Nile Red и выявляли липидо-накап-ливающую способность мутантного штамма C. pyrenoidosa C-2m при длине волны 580 нм. Связываясь с Nile Red, липиды образуют комплексы, максимум поглощения которых находится в области 580 нм [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Интенсификация процесса биосинтеза при практическом использовании микроводорослей проводится в основном тремя путями: оптимизацией условий культивирования, подбором наиболее продуктивных форм из имеющихся в коллекциях и селекцией новых штаммов, обладающих максимальной активностью биосинтеза. Поскольку главным условием получения максимальной продуктивности является правильный выбор культуры, для начала были поставлены следующие задачи: 1) выделение альгологически и бактериологически чистых культур микроводорослей, перспективных для биотехнологического производства, из различных водных экосистем; 2) проведение скрининга по продуктивности и накоплению общих липидов в клетках полученных и коллекционных культур для выявления активных штаммов микроводорослей-продуцентов масла.
Материалом для данной работы послужили микроводоросли, собранные в весенний период 2011 г. С целью выделения альгологически чистых культур был произведен отбор проб из водных экосистем Алматинской обл.: побережья водохранилища Капшагай, сухого русла р. Баканас,
оз. Сорбулак, биопрудов очистных сооружений, болотистой местности, биопрудов Талгарского и Енбекшиказахского р-на, альгобактериальных матов горячих источников Тургеньского ущелья.
Из исследованных проб воды были выделены 12 альгологически чистых культур микроводорослей, которые идентифицированы как представители зеленых микроводорослей рода Scenedesmus — 2 (S. obliquus, S. acuminatus); рода Chlorella — 3 (C. vulgaris, C. pyrenoidosa, C. ellipsoidea, Chlorella sp.); рода Ankistrodesmus — 1 (A. longissimus); рода Chlamy-domonas — 1 (C. reinhardtii); рода Dunaliella — 1 (D. salina). Кроме того, были выделены представители эвгленовых водорослей — 1 (Euglena viridis) и цианобактерий рода Spirulina — 1 (S. major), рода Synechococcus — 1 (S. aeruginosus), рода Nostoc —1 (N. calsicola), рода Anabaena — 1 (A. variabilis). Из них 6 культур были выделены бактериологически чистыми: S. obliquus, C. vulgaris, Chlorella sp., C. reinhardtii, S. platensis, D. salina.
Биотехнологическая перспективность штаммов и видов определяется, в первую очередь, их продуктивностью. Оценку продуктивности выделенных штаммов проводили на основании изучения коэффициентов скорости их роста и определения сухого веса. Для эксперимента были отобраны 4 культуры C. vulgaris, Chlorella sp. 1В, C. reinhardtii, D. salina и 3 коллекционных штамма C. pyrenoidosa C-2, S. obliquus Z-2, Chlorella sp. 2.
Анализ полученных результатов показал невысокие значения коэффициента скорости роста для выделенных культур C. reinhardtii, D. salina и коллекционного штамма Chlorella sp. 3В (рис. 1).
Наиболее быстрым ростом среди выделенных культур отличалась C. vulgaris, коэффициент скорости роста которой был равен 0.24. У коллекц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.