научная статья по теме ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА НАД-ЗАВИСИМОЙ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA - ПРОДУЦЕНТА ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА НАД-ЗАВИСИМОЙ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA - ПРОДУЦЕНТА ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 300-306

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 582.282.23.088.5:577.152.1

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА НАД-ЗАВИСИМОЙ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ УАЯЯО№^1А ЫРОЬУПСА - ПРОДУЦЕНТА ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

© 2004 г. И. Г. Моргунов*, С. В. Камзолова, А. П. Соколов, Т. В. Финогенова

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино

Поступила в редакцию 19.05.03 г.

НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа выделена, очищена и частично охарактеризована из дрожжей Yarrowia 11ро1уПса - продуцента органических кислот. Процедура очистки фермента состояла из четырех стадий: высаливания сульфатом аммония, осаждения кислотой, гидрофобной хроматографии и гель-фильтрации. Получен препарат фермента с удельной активностью 22 мкмоль/(мин мг белка). Исследованы некоторые физико-химические и кинетические свойства НАД-изоцитратдегидрогеназы. Фермент имеет молекулярную массу порядка 412 кДа и состоит из восьми идентичных субъединиц с молекулярной массой 52 кДа. Кт для НАД составляет 136 мкМ, для изоцитрата - 581 мкМ. Изучено влияние некоторых интермедиатов ЦТК и нуклео-тидов на активность фермента. Обсуждается роль НАД-изоцитратдегидрогеназы в процессе синтеза лимонных и кетокислот дрожжами Y. Иро1уйса.

Ключевые слова: дрожжи, цикл лимонной кислоты, изоцитратдегидрогеназа.

Лимитирование роста дрожжей Yarrowia Нро1уйса компонентами среды приводит к экскреции больших количеств (более 100 г/л) органических кислот в среду культивирования. При лимитировании роста тиамином дрожжи накапливают в среде пировиноградную и а-кетоглутаровую кислоты [1], а при лимитировании роста источником азота - лимонную и изолимонную [2]. На способности дрожжей и грибов к "сверхсинтезу" основаны микробиологические способы получения органических кислот. В связи с этим большое внимание уделяется механизмам образования этих кислот дрожжевыми организмами.

Несмотря на хорошо исследованную микробиологическую сторону вопроса [3, 4], биохимические механизмы этих процессов и возможности их регуляции изучены недостаточно. Исчерпание источников питания из среды приводит к перераспределению потоков углерода между катаболи-ческими и анаболическими путями. Центральным путем метаболизма углерода у большинства живых организмов является цикл трикарбоновых кислот (ЦТК). Предполагается, что реакция окислительного декарбоксилирования изоцитрата, катализируемая НАД-зависимой изоцитрат-дегидрогеназой (НАД-ИДГ), является первичным пунктом регуляции ЦТК, в значительной степени определяющей скорость функционирования цикла. Фермент выделен и охарактеризован из ряда источников. Вместе с тем в литературе отсутствуют данные о свойствах НАД-ИДГ из

дрожжей - продуцентов органических кислот. Целью настоящей работы было изучение возможных механизмов регуляции НАД-ИДГ из дрожжей Y. lipolytica и выяснение роли этого фермента в механизме биосинтеза лимонных и кето-кислот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила культура дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 (704), полученная из коллекции культур микроорганизмов ИБФМ РАН.

Дрожжи культивировали в минеральной среде Ридер со смесью микроэлементов Буркгольдера [5] и 0.3% дрожжевого экстракта. В качестве источника углерода использовали глюкозу в исходной концентрации в среде 2%. Культивирование дрожжей проводили в ферментерах АНКУМ-2М (рабочий объем среды 6 л).

Для приготовления бесклеточного экстракта клетки отбирали в начале стационарной фазы роста, осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин и дважды промывали 0.9%-ным раствором NaCl. Клетки ресуспендировали в 50 мМ калий-фсфатном буфере, рН 7.5, содержащем 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ и 0.3 мМ фенилметил-сульфанилфторид, и разрушали с применением стеклянных бус "баллотини" (100-150 мкм) на планетарной мельнице при 1000 об./мин в тече-

ние 3 мин. Суспензию, полученную после разрушения, центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин для удаления неразрушенных клеток и клеточных фрагментов.

Очистка НАД-ИДГ состояла из четырех стадий. На первой стадии в бесклеточный экстракт добавляли сульфат аммония до концентрации 50% от насыщения. При этом основная часть фермента выпадала в осадок. Осадок отделяли центрифугированием при 15000 g в течение 30 мин и растворяли в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.5. Второй этап очистки заключался в осаждении белков при низких значениях рН. Для этого в экстракт, полученный на предыдущей стадии, порциями, при постоянном перемешивании, добавляли 10%-ный раствор уксусной кислоты, доводя рН до 3.5. Полученную суспензию центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Супер-натант, не содержащий активности НАД-ИДГ, отбрасывали, а осадок растворяли в 0.5 М калий-фосфатном буфере, рН 7.5 и вновь центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин для удаления денатурированных белков. На следующем этапе применяли гидрофобную хроматографию. К полученному на предыдущей стадии супернатанту добавляли сульфат аммония до концентрации 2 М. Пробу наносили на колонку (1.6 х 40 см) с октил-сефарозой ("Pharmacia", Швеция), уравновешенную 2 М раствором сульфата аммония в 100 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.5. Колонку промывали 2 М раствором сульфата аммония в буфере до прекращения выхода несвязавшихся белков, после этого ИДГ элюировали 1 М раствором сульфата аммония. Скорость элюции составляла 50 мл/ч. Собирали фракции объемом 12 мл. Фракции, содержащие активность НАД-ИДГ, объединяли, концентрировали высаливанием, доводя концентрацию сульфата аммония до 60% от насыщения. Осадок собирали центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин, растворяли в минимальном объеме 100 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7.5 и вновь центрифугировали для удаления нерастворившихся белков. Супернатант наносили на колонку с сефарозой CL-4B ("Pharmacia", Швеция), уравновешенную 100 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7.5. Элюцию проводили в том же буфере со скоростью 7 мл/ч. Собирали фракции объемом 1.5 мл. Фракции, содержащие активность НАД-ИДГ, объединяли, концентрировали, добавляли глицерин до концентрации 20%, и полученный препарат использовали для дальнейших исследований.

Активность НАД-зависимой ИДГ (К.Ф.1.1.1.4) измеряли спектрофотометрически при 340 нм. Стандартная реакционная смесь содержала: 0.5 мМ НАД, 1 мМ изоцитрат, 5 мМ МgCl2, 0.5 мМ АМФ и 50 мМ КН2РО4, рН 7.4 [6].

Молекулярную массу нативного препарата ИДГ определяли методом гель-фильтрации с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Superose 12HR 1/30 ("Pharmacia", Швеция). Фермент элюировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.4, содержащем 200 мМ NaCl. Скорость элюции 1 мл/мин. В качестве маркеров использовали набор белков с известной молекулярной массой фирмы "Pharmacia", включающий ферритин (440 кДа), альдолазу (160 кДа), БСА (67 кДа), и цитохром с (13 кДа).

Концентрацию белка определяли по связыванию с Кумасси синим [7]. В качестве стандарта использовали БСА. Во фракциях после хроматографии определение белка проводили спектрофотометрически при 280 нм.

SDS-ПААГ электрофорез очищенного препарата фермента проводили в 12.5%-ном ПААГ, содержащем 10% SDS, на приборе для горизонтального электрофореза Fast-System ("Pharmacia", Швеция). Использовали наборы стандартных гелей и реактивов той же фирмы. Белок окрашивали раствором Кумасси R-250, согласно с инструкцией к прибору Fast-System. В качестве маркеров использовали набор белков фирмы "Bio-Rad" (США), включающий белки известной молекулярной массы: фосфорилазу В (92.5-97.4 кДа), БСА (66-68 кДа), овальбумин (43-45 кДа), карбо-ангидразу (29-30 кДа), трипсин (20.1-21 кДа), ли-зоцим (14.3 кДа).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нами разработана эффективная процедура очистки НАД-ИДГ из дрожжей У. Иро^Ыеа. На первой стадии очистки фермент осаждали сульфатом аммония при концентрации 50% от насыщения. Второй этап заключался в осаждении белков изменением рН раствора. После этих двух стадий удалось избавиться от значительного количества балластных белков (общий белок снизился более чем в 18 раз при выходе НАД-ИДГ 67%). В процессе гидрофобной хроматографии НАД-ИДГ связывалась с ок-тил-сефарозой при концентрации сульфата аммония 2 М. После промывки колонки и выхода несвязавшихся белков, фермент элюировали 1 М раствором сульфата аммония (рис. 1). На заключительном этапе фермент очищали с помощью гель-фильтрации на колонке с сефаро-зой-4В. Результаты типичной очистки представлены в табл. 1. НАД-ИДГ очищена в 129 раз с выходом 31%, удельная активность препарата составляла 22 мкмоль/(мин мг белка). Фермент был очищен до гомогенного состояния, что подтверждалось результатами БББ-электрофорез в ПААГ (рис. 2).

Активность, Е/мл 1 М (NH4)2SO4

Белок, E280 10 2 М (NH4)2SO4

8 6 4 2

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Номер фракции

Рис. 1. Хроматография НАД-ИДГ на октил-сефаро-зе: 1 - белок; 2 - активность НАД-ИДГ.

Молекулярный вес нативного препарата НАД-ИДГ определяли методом гель-фильтрации с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Superóse 12HR 1/30. Установлено, что молекулярная масса фермента составляет 412 кДа (рис. 3). Дополнительные эксперименты по определению молекулярной массы на колонке с сефарозой-4В выявили сходное значение, равное 400 кДа. Субъединичный состав фермента определяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. На дорожке с нанесенным образцом была обнаружена единственная полоса, соответствующая 52 кДа (рис. 2). При сравнении этих данных с результатами определения молекулярной массы нативного фермента можно сделать заключение о том, что НАД-ИДГ из дрожжей Y. li-polytica является октамером, состоящим из идентичных субъединиц. Октамерами являются и изучавшиеся ранее НАД-ИДГ из пекарских дрожжей [8] и дрожжей Rhodosporidium toru-loides [9].

Максимальную активность фермент проявлял при рН 7.4. Сдвиг в более щелочную или кислую

(а)

(б)

кДа

-14 -20

-29

-43 -67

-95

Рис. 2. Электрофорез очищенного препарата НАД-ИДГ в денатурирующих условиях: а - препарат НАД-ИДГ; б - набор маркерных белков.

область приводил к быстрой инактивации фермента.

Для в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»