ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2006. том 42, № 1, с. 93-97
УДК 547.963.3
ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ
© 2006 г. Т. В. Ямковая**, В. В. Хомов***, С. Н. Загребельный*, В. И. Ямковой*
* Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск, 630090; e-mail: molbiol@fen.nsu.ru **Новосибирский государственный педагогический университет, г. Новосибирск, 630126 ***Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова, СО РАН, г. Новосибирск, 630090
Поступила в редакцию 10.12.2004 г.
Предложен способ выделения суммарной РНК из пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) путем лизиса биомассы додецилсульфатом натрия (ДДС-Na) при 100°С в течение 40-60 мин с последующим осаждением целевого продукта из раствора 3 М NaCI. Полученный препарат охарактеризован: выход суммарной РНК из 1 кг прессованных дрожжей - 9.25 г, оптическая плотность при 260 нм 1 мг РНК, растворенной в 1 мл воды - 20.2 ед., содержание кислоторастворимой фракции (КРФ) - 2.02%, содержание белка - 1.8%. Из суммарной РНК разработанным нами методом дробного осаждения этанолом с последующей гель-фильтрацией изолирована суммарная тРНК.
Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей в препаративных количествах имеет большое практическое значение, поскольку продукты из нее широко применяют в биохимических процессах разного уровня [1]. Суммарная РНК может быть использована для выделения различных индивидуальных РНК (от тРНК до рРНК), а также для получения моно- и олигори-бонуклеотидов. Набор продуктов из суммарной дрожжевой РНК представлен на рис. 1.
Несмотря на большой интерес к суммарной дрожжевой РНК, описанные в литературе способы ее выделения недостаточно эффективны и требуют совершенствования. При экстракции РНК в препаративных масштабах традиционным фенольным методом возникает проблема утилизации отходов [2, 3]. Экстракция поверхностно активными веществами (ПАВ) при сравнительно низкой температуре и малом времени инкубации [4] чревата деградацией выделяемых молекул. Использование редких ПАВ является серьезным препятствием при масштабировании технологии. И, наконец, добавки ингибиторов рибонуклеаз, например ЭДТА, не решают проблему кардинально, загрязняют конечный продукт и удорожают процесс.
В настоящей статье предложен простой и эффективный способ выделения суммарной РНК из пекарских дрожжей, в котором учтены преимущества и недостатки предыдущих методик. В частности, экстракцию РНК мы проводили кипящим раствором ДДС-Na (крупнотоннажное ПАВ) в течение 40-60 мин, фенол и ингибиторы рибонуклеаз при этом не использовали.
Цель работы - выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей с последующим получением из нее суммарной тРНК.
МЕТОДИКА
В работе были использованы прессованные пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Новосибирский дрожжевой завод) с содержанием воды -70%, суммарная дрожжевая РНК, полученная из Научно-исследовательского конструктор-ско-технологического института биологически активных веществ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", г. Бердск), препараты суммарной дрожжевой тРНК, любезно предоставленные В.В. Власовым и Г.А. Невин-ским из Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск); специальный детергент для лизиса дрожжей Nonidet NP-40 фирмы "Fluka" (Германия), средство для мытья посуды Fairy-plus фирмы "Procter and Gamble"; сефароза 4В фирмы "Pharmacia" (Швеция), 96%-ный этанол (Куйбышевский спиртовый завод, Новосибирская область); ДДС-Na, NaCI, трихлоруксусная кислота (ТХУ) марки "ч" отечественного производства. Для приготовления растворов использовали дистиллированную воду.
Белок определяли методом Варбурга и Кристиана [5].
Оптическую плотность растворов в ультрафиолетовой области спектра измеряли на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, Россия).
Осадки отделяли центрифугированием на центрифуге 6К15 фирмы "Sigma" (Германия).
Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей. Размораживали при комнатной температуре 4 кг дрожжей, измельчали их и суспендировали в 8 л кипящей воды, содержащей 300 г ДДС-Na. Суспензию кипятили 40-60 мин при непрерывном
94
ЯМКОВАЯ и др.
ДРОЖЖИ
1
Рис. 1. Продукты суммарной дрожжевой РНК: / - экстракция и очистка; 2 и 8 - эндорибонуклеаза из яда кобры; 3 -фосфодиэстераза из ядов кобры или гюрзы; 4 - нуклеозидмонофосфаткиназы из Е. coli; 5 — нуклеозиддифосфаткина-за из Е. coli; 6 - сумма ферментов 4 и 5; 7 и /1 - полинуклеотидфосфорилаза из Е. coli', 9 - Т7 РНК-полимераза; 70 -хроматография; 12 - Т4 РНК-лигаза: - дробное осаждение и гель-фильтрация; 14 - рибонуклеаза А и другие эндо-рибонуклеазы, а также Т4 РНК-лигаза и полинуклеотидкиназа.
перемешивании, затем разливали по стальным центрифужным стаканам, помещали их немедленно в лед и охлаждали до 5°С (~15 мин), после чего центрифугировали (17000 g, 10 мин, 4°С). Осадок и часть желеобразной интерфазы отбрасывали, а перешедшую в надосадочную жидкость РНК очищали. Все операции проводили при 0-4°С. К надосадочной жидкости, полученной на предыдущей стадии, добавляли №С1 до 3 М концентрации. После растворения соли суспензию
выдерживали в течение 1 ч для формирования осадка, который далее отделяли центрифугированием (17000 g, 10 мин, 4°С). Осадок промывали двумя порциями по 8 л 3 М №С1, суспендировали в 2 л этанола и оставляли на ночь. На следующий день суспензию центрифугировали (17000 g, 10 мин, 4°С). Осадок растворяли в дистиллированной воде до концентрации РНК 450 £)260,ед./мл (-1.6 л). Раствор осветляли центрифугированием (17000 g, 10 мин, 4°С), после чего из надосадочной жидкос-
ти РНК осаждали, добавляя NaCl до концентрации 0.15 М и равный объем этанола (~2 л). Сформировавшийся осадок отделяли от супернатанта центрифугированием (17000 g, 10 мин, 4°С), промывали 1 л этанола и высушивали в вакуум-экси-каторе над СаС12.
При изучении кинетики экстракции РНК из биомассы дрожжей эксперименты проводили при различных температурах (20°С и 94—100°С).
Фракционирование суммарной РНК из пекарских дрожжей. Все операции проводили при 0-4°С. Растворяли 225 мг суммарной РНК в 10 мл 0.15 М NaCI. К раствору добавляли 10 мл 72%-но-го этанола. Перемешивали ~30 мин до образования осадка и затем центрифугировали (16000 g, 5 мин, 4°С). Супернатант сливали, а осадок промывали 20 мл этанола и высушивали в вакуум-эк-сикаторе над СаС12. Далее супернатант и осадок подвергали гель-фильтрации на сефарозе 4В.
Гель-фильтрацию РНК на сефарозе 4В проводили по методу [6] с использованием хроматогра-фической системы фирмы "LKB" (Швеция). Колонку с сефарозой (1.5 х 26 см) уравновешивали 0.15 М NaCl. Наносили на нее 1 мл раствора РНК с концентрацией ~10 £>26о> ед./мл и элюировали 0.15 М NaCl со скоростью 30 мл/ч. В элюате измеряли оптическую плотность при 254 нм.
Содержание КРФ в РНК определяли разработанным нами методом. Для этого 0.5 мл водного раствора РНК с концентрацией 5-30 £>260, ед./мл вносили в пробирку Eppendorf на 1.5 мл, добавляли туда же 0.5 мл 10%-ного раствора ТХУ, компоненты в пробирке перемешивали и ставили ее в ледяную баню на 30 мин, затем центрифугировали (1500 g, 3 мин, 25°С). Содержание КРФ в супер-натанте определяли по его оптической плотности при 260 нм. Гиперхромный эффект не учитывали.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение РНК из дрожжей начинают с ее экстракции. Последнюю, с точки зрения экологии, желательно проводить без использования фенола и других трудноутилизируемых соединений. Одним из приемлемых способов является экстракция экологически безопасными ПАВ.
В связи с появлением новых ПАВ в настоящей работе были использованы NP-40 и Fairy-plus, а также традиционный препарат ДДС-Na, предложенный Крестфилдом [4]. Как видно из рис. 2, препарат Fairy-plus оказался менее эффективным по сравнению с ДДС-Na и NP-40, которые лизиру-ют дрожжи практически с одинаковой эффективностью. На рис. 3 представлены спектры РНК, полученных при использовании различных ПАВ. Видно, что применение препарата NP-40 сопряжено с интенсивным вымыванием из клеток дрожжей большого количества балластного бел-
мин
Рис. 2. Кинетика экстракции РНК из пекарских дрожжей:
1,3- ДДС-Na, 2 - NP-40,4 - Fairy-plus. Концентрация ПАВ: I - 2.5%, 2-4 - 5%; температура: 1 - 94—100°С, 2-4 - 20°С.
нм
Рис. 3. Спектры поглощения экстрагированной РНК: 1 - ДДС-Na и очищенной РНК, 2 - NP-40 РНК, 3 -ДДС-Na РНК, 4 - Fairy-plus РНК.
ка (2 на рис. 3 имеет максимум поглощения не при 260, а при 275 нм). В случае использования ДДС-Na (рис. 3, 5) максимум поглощения (265 нм) очень близок к максимуму поглощения очищенной РНК (260 нм, рис. 3, /). Спектр поглощения РНК, экстрагированной Fairy-plus (рис. 3, 4), имеет вообще не нуклеотидный характер. В связи с этим в дальнейшей работе для лизиса дрожжевых клеток был использован ДДС-Na. Деградации выделяемой РНК нам удалось избежать, проводя экстракцию в кипящей воде в течение длительного времени (40-60 мин). В этих условиях денатурируют все эндогенные и примесные рибонукле-
96
ЯМКОВАЯ и др.
£>254- ед-1.0
0.5
О 1.5
1.0
0.5
(а)
(б)
Рис. 4. Гель-фильтрация суммарной дрожжевой РНК на сефарозе 4В:
а - выделенная по методу [4]; б - нашим методом.
азы, а также осуществляется надежная стерилизация экстракта. При этом соответствующая кинетическая кривая экстракции РНК (рис. 2, 1) выходит на плато.
Очистка суммарной РНК из пекарских дрожжей
Стадия очистки Выход РНК, Я260> ед" Выход РНК*, %
Экстракция суммарной РНК 1909800 100
Осаждение 3 М ЫаС1 1318800 69
Промывание 3 М ЫаС1 1087600 57
Промывание 96%-ным 1059800 55
этанолом
Растворение в воде до 450£>2бо> 760000 40
ед./мл
Осаждение 48%-ным 755600 -40
этанолом с 0.15 М №С1
* Из 4 кг исходной биомассы.
Для последующего использования суммарной дрожжевой РНК важна степень ее полимерности. Для ее оценки полученный препарат был подвергнут гель-фильтрации. Соответствующая хро-матограмма в сравнении с РНК, полученной методом [4], приведена на рис. 4. Как видно из рисунка, выделенная нами РНК элюируется более острыми пиками, что сви
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.