РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2012, том 6(15), № 1, с. 35-44
- ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ ==
ВЫСОКИЕ УРОВНИ ИНТЕРЛЕЙКИНА 2 И ИНТЕРФЕРОНА ГАММА В ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ И В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КОРРЕЛИРУЮТ СО СНИЖЕНИЕМ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ БЕСПЛОДИЯ МЕТОДОМ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО
ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
© 2012 г. А.Г. Абдулмеджидова*, А.С. Цибизов*, К.В. Краснопольская**, Е.И. Померанцева***, Н.К. Красова***, А.А. Кущ*
*
ФГУ «НИИвирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России,
отдел молекулярной вирусологии, Москва, Россия;
**
ГУЗ МОНИИАГ, отделение репродукции, Россия;
Медицинский Центр вспомогательных репродуктивных технологий «Новая жизнь»,
Москва, Россия
Поступила: 31.05.2011. Принята: 16.01.2012
Изучение взаимодействия иммунной и репродуктивной систем необходимо для раскрытия причин нарушения фертильности и разработки средств лечения мужского и женского бесплодия. Цель настоящей работы состояла в изучении частоты выявления и концентрации ряда цитокинов и факторов роста в фолликулярной жидкости (ФЖ) и в сыворотке крови (СК) пациенток, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО, и в анализе влияния цитокинов на ранние стадии эмбриогенеза и частоту наступления клинической беременности (ЧНБ). При пункции фолликулов от 243 пациенток были получены 2962 ооцитов (12,8±6,67 клеток на пациентку). Пациенткам было перенесено в среднем по 2,7±0,7 эмбрионов. Доля имплантировавшихся эмбрионов составила 12,5%. В результате проведения ЭКО беременность наступила у 75/243пациенток (30,8%). Установлено, что концентрация ТЫБ-а в ФЖ была выше, чем в СК. Концентрации ¡Ь-2 и ¡БЫ-т в ФЖ коррелировали с уровнями данных цитокинов в СК; для ¡Ь-1$, ¡Ь-4, ¡Ь-6, ¡Ь-10, ¡БЫ-а и ТЫБ-а указанная корреляция не обнаружена. Уровень ¡Ь-4 у пациенток с наступившей беременностью был значительно ниже, чем при неудаче ЭКО. Показано, что негативное влияние на исход ЭКО проявляется при концентрациях цитокинов в ФЖ и в СК, превышающих: ¡Ь-2 — 15 пкг/мл и 9 пкг/мл, соответственно; ¡БЫ-т — 11 пкг/мл и 5 пкг/мл, соответственно; ¡БЫ-а в ФЖ — 11 пкг/мл. У пациенток с высоким уровнем данных цитокинов беременность наступила в 4,6% случаях, с низким уровнем — в 33,1% случаев (р = 0,001). Суммируя результаты, можно заключить, что высокие концентрации провоспалительных цитокинов ¡Ь-2 и ¡БЫ-т в ФЖ и в СК оказывают негативное влияние на репродуктивную функцию, на развитие предимплантационных эмбрионов человека и значительно снижают эффективность лечения бесплодия методом ЭКО.
Ключевые слова: цитокины, фолликулярная жидкость, экстракорпоральное оплодотворение
ВВЕДЕНИЕ
Изучение роли иммунной системы в осуществлении репродуктивной функции человека является одним из актуальных направлений современной биологии и медицины.
Адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи,16. НИИ вирусологии Минздравсоцразвития РФ. E-mail: vitallku@mail.ru
В то же время иммунные механизмы, оказывающие влияние на разные стадии этого процесса, изучены недостаточно. Понимание взаимодействия иммунной и репродуктивной систем необходимо для раскрытия причин нарушения фертильности и разработки средств лечения мужского и женского бесплодия. В настоящее время бесплодием страдают более 70 млн пар во всем мире, однако результаты лечения методами вспо-
могательных репродуктивных технологий остаются относительно невысокими. Так, средняя частота наступления беременности в цикле экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) составляет 30 — 40%. В связи с этим активно ведутся поиски средств и методов повышения эффективности лечения бесплодия, а также выявления маркеров, которые позволили бы прогнозировать результаты проведения ЭКО. Особый интерес представляет выяснение роли цитокинов, иммунорегуляторная функция которых в репродукции человека мало изучена. В связи с этим перспективным представляется выяснение экспрессии цитокинов в фолликулярной жидкости (ФЖ) и в сыворотке крови (СК) у пациенток с бесплодием, проходящих лечение методом ЭКО.
В настоящей работе изучены частота выявления и концентрации интерлейкинов (1Ь-1р, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6 и 1Ь-10), интерферонов (1БЫ-а и №N-7), факторов роста (колониестимулирую-щего фактора гранулоцитов — G-CSF и коло-ниестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов — GM-CSF), а также фактора некроза опухоли а (ТЫБ-а) в ФЖ и в СК пациенток с бесплодием. Проведен анализ влияния цитокинов на ранние стадии эмбриогенеза и частоту наступления беременности (ЧНБ). Показано, что высокие концентрации 1Ь-2 и в ФЖ коррелируют с неблагоприятным исходом лечения бесплодия и могут использоваться для прогнозирования эффективности ЭКО.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты
Обследовали 243 пациентки с бесплодием в браке, 206 из которых проходили лечение в отделении репродукции МОНИИАГ (г. Москва) и 37 пациенток — в Медицинском Центре вспомогательных репродуктивных технологий «Новая жизнь» (г. Москва). У 107 пациенток из 243 наблюдали первичное бесплодие, у 136 пациенток — вторичное бесплодие. Критериями включения в группу являлись: возраст не менее 19 и не более 38 лет (средний возраст пациенток составил 34,3±5,4 года), индекс массы тела не менее 19 и не более 25 кг/м2, базальный уровень ФСГ не более 9 МЕ/л, отсутствие генетических нарушений, экстрагенитальной эндокринной патологии, системных заболеваний им-
мунно-воспалительного характера, а также отсутствие активной инфекции бактериальной или вирусной этиологии. По результатам обследования 243 пар было установлено, что причинами бесплодия были: трубно-пери-тонеальный фактор (п = 57), эндокринный фактор (п = 38), иммунологический фактор (п = 19), эндометриоз (п = 29), мужской фактор (п = 69) и отсутствие полового партнера (п = 15). В ряде случаев причина бесплодия не была установлена — идиопатическое бесплодие (п = 16).
От всех пациентов было получено добровольное информированное согласие на проведение данного обследования.
Проведение экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)
Стимуляция функции яичника проводилась по стандартному длинному протоколу с применением агонистов гонадотропин ри-лизинг гормона (а-ГнРГ) и гонадотропинов. Фолликулярную жидкость собирали во время аспирации фолликулов и исследовали вирусологическими, молекулярными и иммунологическими методами как описано ниже. Ооциты, полученные от 155 пациенток, оплодотворяли методом ЭКО, ооциты от 88 пациенток — методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) по стандартным схемам [1]. Оплодотворенные ооциты и развивающиеся эмбрионы культивировали с использованием коммерческих сертифицированных сред фирмы СООК (Австралия) и МеШСиК (Дания) в условиях, рекомендуемых фирмой-производителем. Эмбрионы переносили в полость матки на второй-третий день развития. Для переноса, как правило, отбирали не более 3 эмбрионов наиболее высокого качества. Оставшиеся после переноса эмбрионы культивировали до пятого дня развития и криоконсервировали на стадии бластоцис-ты с использованием протокола медленной криоконсервации, рекомендованной фирмой СООК (Австралия).
Для оценки эффективности ЭКО определяли: частоту оплодотворения ооцитов, частоту дробления эмбрионов, морфологию развивающихся эмбрионов, частоту достижения стадии бластоцисты и частоту наступления клинической беременности (ЧНБ) в циклах ЭКО на процедуру переноса эмбрионов пациентке.
Количественный анализ цитокинов
Содержание цитокинов IL-1 b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a, IFN-c и TNF-a в ФЖ и в СК изучали с помощью сертифицированных коммерческих наборов для иммунофер-ментного анализа (ИФА) фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Для количественного анализа G-CSF использовали тест-систему^пуигодеп» (Великобритания), GM-CSF — тест-систему «Biosource» (Бельгия). Чувствительность определения при проведении измерений в условиях наших опытов оценивалась по минимальной достоверно определяемой концентрации, рассчитанной на основании среднего арифметического значения из десяти измерений оптической плотности калибровочного образца из тест-системы F — 0 пг/мл, плюс 2v, где v — среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения. Минимальная выявляемая концентрация IL-1 не превышала 0,2 пкг/мл, IL-2 — 2 пкг/мл, IL-4 — 0,4 пкг/мл, IL-6 — 0,5 пкг/мл, IL-10 — 1 пкг/мл, TNF-a — 2 пкг/мл, IFN-a — 4 пкг/мл, IFN-c — 4 пкг/мл, G-CSF - 20 пкг/мл, GM-CSF - 1 пкг/мл.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ Excel и «BIOSTAT». Для установления корреляции определяли коэффициент корреляции. Достоверность различий оценивали с использованием критериев Манна-Уитни, Стьюден-та, Фишера и |2. Различия считали достоверными при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Показатели экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)
При трансвагинальной пункции фолликулов от 243 пациенток были получены 2962 ооцитов. Количество ооцитов варьировало от 1 до 42 и в среднем составило 12,8± ±6,67 клеток на пациентку. Из общего числа полученных клеток зрелыми были 91% ооцитов (2700/2962).
Из 2700 яйцеклеток в результате инсеминации и процедуры ИКСИ оплодотворились 2310 клеток — 86%. Из числа полученных зигот в дальнейшем дробились 2148 эмбрионов — 93%. Всего 243 пациенткам было перенесено 657 эмбрионов (в среднем 2,7±0,7 эмбрионов на пациентку). Доля имплантировавшихся эмбрионов составила 12,5% (82/657). В результате проведения ЭКО беременность
наступила у 75 пациенток из 243, ЧНБ составила 30,8%.
Количественный анализ цитокинов
При изучении цитокинов в ФЖ и в СК было установлено, что частота выявления цитоки-нов в изученных биологических материалах существенно варьирует. Данные представлены в табл. 1. 1Ь-4 и 1Ь-6 были выявлены в ФЖ с высокой частотой: 70,4% и 94%, соответственно. В то же время в СК уровни 1Ь-4 были ниже порога чувствительности определения у всех обследованных пациенток, 1Ь-6 был обнаружен в СК только у одной из них. Другие цито-кины были выявлены в обоих биологических материалах, но с различной частотой: 1Ь-1р, 1БЫ-а и в ФЖ определялись реже, чем
в СК; 1Ь-2, 1Ь-10 и ТЫБ-а — практически с одинаково высокой частотой. Уровень ТЫБ-а был достоверно выше в ФЖ, чем в СК (р = 0,003). Ростовые факторы G-CSF и GM-CSF изучали только в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.