ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2009, том 64, № 3, с. 313-317
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 535.37,543.54
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НИТРОЭФИРОВ С ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
© 2009 г. Ю. Б. Цаплев
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
119991 Москва, ул. Косыгина, 4 Поступила в редакцию 20.12.2007 г., после доработки 05.03.2008 г.
Разработана методика хроматографического определения нитроэфиров с хемилюминесцентным детектированием на основе хемилюминесцентной реакции 4-диметиламинофталгидразида с лабильными продуктами их щелочного гидролиза. Предел обнаружения нитроглицерина - 0.01 нг, тетра-нитропентаэритрита - 1 нг, динитрата изосорбида - 9 нг.
Хроматографическое определение с хемилюминесцентным детектированием является быстро развивающимся методом [1]. Хемилюминесцентное детектирование обеспечивает значительно более высокую чувствительность, чем другие оптические, например, спектрофотометрические, способы детектирования. Для нитроэфиров, имеющих малые коэффициенты поглощения в области спектра с длиной волны больше 210 нм, это является особенно важной причиной поиска новых способов детектирования [2].
Была описана и изучена хемилюминесцентная реакция люминола (и его аналогов) с лабильными продуктами щелочного гидролиза нитроглицерина [3]. Хемилюминесцентные превращения фталгидра-
зидов запускает пероксинитрит (ОКОО ), образующийся с выходом около 5% при взаимодействии Я-О-Ш2 с ОН-:
Я-О-Ш2 + ОН-ОШОН -
— Я-О- + ОШОН, ОШО- + Н+.
Вполне естественно предположить, что данная реакция протекает не только в случае нитроглицерина, но и для других нитроэфиров.
Для исследований были выбраны следующие нитроэфиры: тринитроглицерин (НГ), тетранитро-пентаэритрит (ТЭН), динитрат изосорбида (ДНС) и нитроцеллюлоза (НЦ); их структурные формулы представлены ниже.
02Ш
Н
Н
0Ш2
ДНС
СН2—0Ш I 2 ■
СН-0Ш2 I 2
СН2—0Ш
НГ
0Ш2
2 СН2
02Ш-СН2-С-СН2—0Ш2
2 СН2
I 2 0Ш2
ТЭН
1 С
—0
0Ш2 I 2 С-0
Н, . I/ Н
0
С
0Ш2Н/^
С I
0Ш2
С
|\Н
0Ш2 I 2
С
0М02^\Н
0
0Ш2
>
0
НЦ
п
Первые три вещества являются основой хорошо нита и нитросорбида. Их определение представляет известных фармпрепаратов: нитроглицерина, эри- интерес для фармацевтической химии [4]. Вместе с
Рис. 1. Функциональная схема хроматографической системы с хемилюминесцентным детектором.
тем, НГ, ТЭН и НЦ - это и взрывчатые вещества, причем ТЭН сложно обнаруживать средствами газового анализа, особенно в составе пластических взрывчатых веществ [5, 6]. А для обнаружения НЦ использование газового анализа вообще проблематично. По этой причине анализ нитроэфиров, в том числе средствами ВЭЖХ, представляет интерес для криминалистики [2].
Использование обращенно-фазового варианта ВЭЖХ для анализа нитроэфиров связано с тем, что молекулы всех этих вещества полярны и гидрофоб-ны, растворимость их в воде мала. В этом случае вполне можно использовать рекомендации по выбору элюента среди смесей ацетонитрил-вода или метанол-вода [7]. Первые удовлетворительные результаты разделения нитроэфиров методом ВЭЖХ с УФ-детектированием получены для НГ и продуктов его гидролиза на сорбентах, модифицированных алкильными группами С18, в работах [8-10]. В качестве подвижной фазы использовали смеси (40 : 60) метанол-вода или (36 : 64) ацетонитрил-вода [8-11]. Расход подвижной фазы в обоих случаях был довольно высоким (1-2 мл/мин). В аналогичных условиях получено разделение смеси НГ, ТЭН и ДНС [12]. Продолжительность разделения составляла около 40 минут. Для разделения ТЭН и продуктов его гидролиза в [13] использовали обращенно-фазо-вый сорбент с С8-группами, а в качестве подвижной фазы - смесь (65 : 35) ацетонитрил-вода с добавлением формиата аммония (0.05 М) в качестве модификатора. Расход подвижной фазы - 250 мкл/мин. Предел обнаружения нитроэфиров в ВЭЖХ с УФ-детектированием составлял, как правило, несколько сотен нг нитроэфира в пробе.
Целью работы является разработка способа хроматографического определения нитроэфиров методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с детектированием на основе послеколоночной хемилюминес-центной реакции.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты. Исходные растворы НГ, ТЭН и ДНС готовили из таблетированных форм соответствующих фармпрепаратов. Таблетки растирали в порошок, активное вещество экстрагировали ацетонит-рилом, полученные растворы фильтровали. Концентрацию активного вещества в растворе находили по поглощению в УФ-области на основе данных, представленных в [14]. Нитроэфиры вводили в хро-матографическую колонку в виде растворов в подвижной фазе.
Для приготовления растворов НЦ брали пороха "Сокол" и "Барс". Крупинки пороха первоначально растворяли в ацетоне и диметилсульфоксиде (ДМСО).
Хемилюминесцентным реагентом (Ь) служил 4-диметиламинофталгидразид (производства АрмИРЕА), который является аналогом люмино-ла с защищенной аминогруппой и сохраняет высокий квантовый выход хемилюминесценции в сильнощелочной среде [15]. Рабочий раствор хемилю-минесцентного реагента содержал 0.04 г/л Ь, 0.2 М КОН и 0.8 г/л трилона Б, а также ДМСО, ацетонит-рил и Н20, взятые в соотношении (10 : 5 : 4) по объему.
В работе использовали ацетонитрил (Экос-1, Россия) и ДМСО (Химреактивкомплект, Россия) без дополнительной очистки.
Оборудование. Хроматографическая система (рис. 1) была собрана на основе хроматографиче-ской колонки диаметром 2 мм и длиной 80 мм с сорбентом Диасорб 130С16Т для обращенно-фазовой хроматографии зернением 6 мкм. Подвижную фазу и раствор реагента подавали посредством шприце-вых насосов двух систем подачи жидкости СПЖ-5001 (Медикант, Россия) с одинаковым расходом, равным 120 мкл/мин. Забор пробы объемом 5 мкл и её ввод в колонку выполняли с помощью ин-
0 Li_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
t, c
Рис. 2. Зависимость интенсивности ХЛ от времени при добавлении 10 мкл раствора НГ (1), ТЭН (2) и ДНС (3) в смеси (1 : 1) ацетонитрил - вода к 380 мкл раствора хемилюминесцентного реагента. Содержание НГ - 10 нг, ТЭН - 300 нг, ДНС - 2 мкг.
жекционной иглы, соединенной с СПЖ-5001 линии подвижной фазы.
Для регистрации хемилюминесценции (ХЛ) использовали фотоприемный модуль Н7360 (Hamamatsu, Япония), работающий в режиме счета фотонов, счетчик импульсов CNT-102 (Спецприбор, Беларусь), имеющий USB интерфейс для связи с компьютером, и компьютер.
Проточный хемилюминесцентный реактор объемом около 20 мкл был изготовлен из политет-рафторэтиленовой трубки длиной 20 см, свернутой в спираль.
Для наблюдения хемилюминесцентных реакций в пробирке растворы реагентов смешивали в полипропиленовых микропробирках объемом 1.5 мл. ХЛ в этом случае регистрировали посредством компьютеризированного фотометра.
Предварительные опыты по подбору условий хроматографического разделения были выполнены с УФ-детектором, в качестве которого служил прибор "Флюорат-02-Панорама" с проточной хро-матографической кюветой объемом 6 мкл (Люм-экс-Центрум, Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Активация хемилюминесцентного реагента при щелочном гидролизе ТЭН, НЦ и ДНС. Установлено, что щелочной гидролиз ТЭН, ДНС и НЦ, как и НГ, сопровождается образованием лабильных продуктов, активирующих хемилюминесценцию производных люминола. В отличие от НГ гидролиз ТЭН, ДНС и НЦ в водных щелочных растворах протекает очень медленно, и максимальная интенсивность ХЛ наблюдается через сотни минут от начала реакции.
Скорость щелочного гидролиза этих соединений, как и в случае НГ, значительно возрастает в присутствии ДМСО [3, 16, 17]. На рис. 2 представлена зависимость интенсивности ХЛ от времени при смешивании в микропробирке раствора нитроэфира с хемилюминесцентным реагентом в присутствии около 50 об. % ДМСО. Видно, что в присутствии ДМСО максимальная интенсивность ХЛ наблюдается уже в течение первых 5 с после смешивания растворов. Следовательно, наблюдаемую в присутствии ДМСО хемилюминесцентную реакцию можно использовать в качестве аналитической реакции для детектирования нитроэфиров в методе ВЭЖХ.
ВЭЖХ нитроэфиров. С помощью регистрации поглощения при 230 нм установлено, что удовлетворительное разделение смеси ДНС, НГ и ТЭН достигается при использовании в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил-вода, взятых в равных объемах. При расходе подвижной фазы 120 мкл/мин соединения разделяются за 10 мин.
При хемилюминесцентном детектировании в соответствии со схемой, представленной на рис. 1, поток элюата после колонки смешивается с потоком хемилюминесцентного реагента и поступает в проточную ячейку. На рис. 3 представлены хромато-граммы, полученные при разделении в оптимальных условиях смеси, содержащей 330 нг ДНС, 1 нг (кривая 1) или 0.25 нг (кривая 2) НГ и 5 нг ТЭН. Времена удерживания ДНС, НГ, ТЭН 4.5, 5.6 и 8.8 мин соответственно.
На рис. 4. представлены градуировочные графики, построенные по высотам хроматографических пиков. В пробах объемом 5 мкл предел обнаружения (3а - критерий) для НГ - 0.01 нг, ТЭН - 1 нг, ДНС - 9 нг, что на несколько порядков меньше, чем в методе ВЭЖХ с УФ-детектированием. На вставке
10 г
и
О
^
X 6 л н о
§ 4 я к о
м £2 К
7 8 9 10
2.1 2.0 1.9
4
7
I, мин
10
Рис. 3. Хроматограммы смеси ДНС, НГ и ТЭН при хемилюминесцентном детектировании. Пики: I - ДНС, II - НГ, III - ТЭН. Объём пробы 5 мкл, содержание ДНС - 330 нг, НГ - 1 (1) и 0.25 (2) нг, ТЭН - 5 нг. На вставке показана нестабильность фонового сигнала.
0
5
6
Рис. 4. Зависимость высоты хроматографического пика от массы нитроэфира в пробе объемом 5 мкл для НГ (а), ТЭН (б) и ДНС (в).
рис. 3 в увеличенном виде показана хроматограмма пробы, не содержащей целевых соединений (контрольный опыт). Видим, что фоновый сигнал имеет регулярную структуру. Основным источником "шума", который ограничивает предел обнаружения, является неравномерность поступления хемилюми-несцентного реагента и подвижной фазы в проточный реактор. В окно хроматограммы 0-3 мин попадают активные помехи, к которым относятся щелочи (1.4 мин), пероксид водорода (1.9 мин) и
гипохлорит (3 мин). Они не мешают обнаружению целевых соединений.
Разработанная методика определения нитро-эфиров методом об
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.