БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 7, с. 1109 - 1118
УДК 577.114
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ ГЛИКОМНЫЙ АНАЛИЗ: ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОБОПОДГОТОВКИ
© 2015 И. Трбоевич Акмачич1, И. Угрина1, Дж. Штамбук1, И. Гудель1, Ф. Вучкович1, Г. Лауц12, М. Пучич-Бакович1*
1 Исследовательская лаборатория Genos Glycoscience, Хорватия, 10 000 Загреб, Хондлова, 2/11; факс: +385-1-2352-667; электронная почта: mpucicbakovic@genos.hr
2 Университет Загреба, факультет фармакологии и биохимии, Хорватия, 10 000 Загреб, А. Ковачича, 1
Поступила в редакцию 02.02.15 После доработки 24.02.15
Известно, что гликозилирование влияет на структуру, фолдинг и функцию множества белков, а нарушения гликозилирования связаны с различными заболеваниями. Разработано множество методов анализа глика-нов в составе иммуноглобулинов (в основном IgG), однако анализ гликанов суммарных белков плазмы крови развит гораздо меньше из-за дополнительных проблем, возникающих вследствие большей сложности образца. В настоящей работе мы описываем разработку и оптимизацию высокоэффективного метода про-боподготовки для анализа N-гликанов белков плазмы с помощью разновидности жидкостной хроматографии HILIC в ее сверхвысокоэффективном варианте (HILIC—UPLC). Было показано, что основным источником вариативности является стадия очистки меченых гликанов; для лучшей воспроизводимости мы протестировали целлюлозу, силикагель, биогель и гидрофильный GHP-фильтр в качестве неподвижной фазы для твердофазной экстракции. Было показано, что все они подходят для очистки меченых гликанов, однако метод с использованием планшетного фильтра GHP и холодного 96%-ного ACN более удобен и обеспечивает наиболее высокую воспроизводимость. Метод был дополнительно оптимизирован с использованием скрининга Плакетта—Бермана и валидирован в отношении анализа вариативности основных шагов, а также вариативности по дням и исполнителям. Разработанный метод является быстрым, экономичным и удобным в использовании, обладает хорошей воспроизводимостью и позволяет оценивать разнообразие N-гликома плазмы стабильно на протяжении длительных периодов времени.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: плазма крови, гликаны, гликомный анализ, HILIC, UPLC.
Гликозилирование — присоединение углеводных остатков (гликанов) к белкам — является котрансляционной и посттрансляционной модификацией белков, влияющей на структуру гликопротеина, правильный фолдинг и, как следствие, на его функцию. Гликозилирование необходимо для взаимодействия белков на поверхности клетки, клеточной передачи сигнала и распознавания. Оно является результатом воздействия как генетических факторов, так и факторов внешней среды. Изменения в характере гликозилирования связаны с различными болезнями, такими как аутоиммунные и инфекционные заболевания, врожденные нарушения
Принятые сокращения: 2-АВ — 2-аминобензамид, 2-РВ — 2-пиколинборан, АСМ — ацетонитрил, НЮС — жидкостная хроматография за счет гидрофильного взаимодействия, 8РЕ — твердофазная экстракция, ЦРЬС — сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография, КВ — коэффициент вариации, СКО — среднеквадратическое отклонение.
* Адресат для корреспонденции.
гликозилирования и рак [1, 2]. Таким образом, необходим чувствительный, хорошо воспроизводимый и высокоэффективный метод анализа гликанов. В настоящее время существует несколько высокоэффективных подходов к анализу гликанов: сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография (ИРЬС), жидкостная хрома-то-масс-спектрометрия (ЖХ—МС), капиллярный гель-электрофорез (СОЕ) и матрикс-ассо-циированная лазерная десорбция-ионизация — масс-спектрометрия (МАЬВ1—М8), которые недавно сравнили при анализе гликозилирова-ния [3]. иРЬС получила широкое распространение из-за относительно низкой стоимости оборудования, очень качественного, надежного и устойчивого количественного анализа и способности разделять изомеры гликанов. На настоящий момент стандартная процедура анализа методом иРЬС включает в себя дегликозилиро-вание белков, введение метки в отщепленные гликаны с помощью флуоресцентного красителя (как правило, 2-аминобензамида, 2-АВ),
процедуру очистки для удаления избытка реагентов и, в заключение, флуоресцентное определение меченых очищенных гликанов. Ранее в литературе были описаны другие подходы к организации процесса подготовки образцов [4—6]. Одно время «золотым стандартом» было дегли-козилирование иммобилизованных белков на 8В8-РЛОБ-геле, предложенное Ройлем с соавт. [4], которое было очень трудоемким и требовало трех дней работы, причем эффективность извлечения гликанов из геля могла влиять на воспроизводимость метода. Бурнина с соавт. [5] и Стокманн с соавт. [6] разработали методику подготовки образцов для анализа М-гликанов методом иРЬС с использованием гидрофобных и 10 кДа 96-луночных планшетов соответственно. Однако по нашему опыту эти планшеты не давали устойчивой воспроизводимости, имели ограниченную пропускную способность или требовали дополнительных стадий очистки, что превращало приготовление образцов в процесс, требующий длительного времени, и лишало его преимущества в экономичности. Разработка методов анализа М-гликанов была в основном направлена на анализ коммерческих антител или антител, выделенных из крови человека, конкретно Анализ М-гликанов общей плазмы или сыворотки крови представляет собой более сложную задачу из-за присутствия множества различных гликопротеинов, образующихся в разных типах клеток, характер гликозилирования которых зависит от типа клетки, а концентрация в различных физиологических процессах может варьироваться [7—9]. Кроме того, М-гликом плазмы и сыворотки содержит более сложные сиалилированные структуры гликанов, склонных к десиалилированию. При наличии стольких уровней сложности очень важно разработать метод с приемлемым уровнем экспериментального шума, — в идеале более высокоэффективный, легкий в реализации, относительно дешевый и воспроизводимый. В настоящей работе описаны разработка, оптимизация и валидация именно такого метода пробоподготовки для анализа М-гликанов плазмы методом иРЬС.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Образцы плазмы. Для разработки метода и всех экспериментов по оптимизации, а также в качестве стандарта при изучении вариативности по дням и исполнителям использовали пулы плазмы троих практически здоровых мужчин-волонтеров. Для экспериментов по вариативности по дням и исполнителям использовали
образцы плазмы пяти здоровых мужчин-волонтеров и пяти здоровых женщин-волонтеров в возрасте 30—45 лет (средний возраст 33,0, СКО = 6,8) и 29—46 лет (средний возраст 31,0, СКО = 7,5) соответственно, которые собирали в течение трех отдельных дней (первый, второй и десятый дни). Из образцов готовили аликвоты, которые замораживали и хранили при —20° до дня проведения эксперимента.
Отщепление гликанов и введение метки. Всю процедуру проводили в 96-луночном планшете, на протяжении всего эксперимента использовали сверхчистую воду. Образец плазмы (10 мкл) денатурировали добавлением 20 мкл 2%-ного (w/v) SDS («Invitrogen», США) и инкубацией при 65° в течение 10 мин. После охлаждения до комнатной температуры в течение 30 мин к раствору добавляли 10 мкл 4%-ного (v/v) Igepal-CA630 («Sigma-Aldrich», США), и смесь перемешивали в течение 15 мин на планшетном шейкере («GFL», Германия). N-гликаны отщепляли добавлением 1,2 ед PNGase F («Promega», США) в 10 мкл 5х PBS и инкубацией при 37° в течение ночи. В отщепленные N-гликаны вводилась метка (2-аминобензамид, 2-АВ). Смесь для введения метки была приготовлена непосредственно перед началом эксперимента путем растворения 2-АВ (19,2 мг/мл, «Sigma-Aldrich», США) и 2-пиколинборана (2-PB, 44,8 мг/мл, «Sigma-Aldrich», США) в смеси диметилсульфоксида («Sigma-Aldrich», США) и ледяной уксусной кислоты («Merck», Германия) (70 : 30, v/v). К каждому образцу N-гликана в 96-луночном планшете добавляли 25 мкл смеси для введения метки, планшет запечатывали адгезивной пленкой, перемешивали в течение 10 мин с последующей инкубацией при 65° в течение 2 ч.
Процедуры очистки. Свободную метку и восстанавливающий агент удаляли из образца с помощью HILIC—SPE. После охлаждения до комнатной температуры в течение 30 мин образцы (в объеме 75 мкл) доводили до нужной концентрации ацетонитрила (ACN, v/v) путем добавления 300 мкл ACN («Fluka», США) (для 80%-ного), 675 мкл ACN (для 90%-ного) или 700 мкл ACN (для >90%-ного). 200 мкл водной суспензии (0,1 г/мл) микрокристаллической целлюлозы («Merck», Германия), силикагеля (15 мкм, 30—60 меш, «Sigma-Aldrich», США) или биогеля P (50—100 меш, «Bio-Rad», США) в смеси вода-этанол—ацето-нитрил (70 : 20 : 10: v/v/v, после инкубации при комнатной температуре в течение 4 ч перед использованием) вносили в каждую лунку 0,2-мкм планшетного фильтра GHP («Pall Corporation», США). Растворитель удаляли под вакуумом с использованием вакуумного коллектора («Millipore Corporation», США). Все лунки были предвари-
тельно промыты 5 х 200 мкл сверхчистой воды с последующим уравновешиванием с использованием 3 х 200 мкл холодного (4°) ACN в той же концентрации, которая использовалась для последующей процедуры отмывки (80, 90 или 100%, v/v). При использовании в качестве неподвижной фазы только 0,2-мкм GHP-фильтра лунки предварительно промывали 200 мкл 70%-ного этанола (v/v), 200 мкл сверхчистой воды и 200 мкл холодного ACN в той же концентрации, которая использовалась для последующей процедуры отмывки (80, 90, 92, 96 или 100%, v/v). Образцы загружали в лунки и после краткосрочной инкубации промывали 7 х 200 мкл ACN в указанной концентрации. Для каждой комбинации «неподвижная фаза/концентрация ACN» для оценки масштаба потери гликанов собирали все смывы для первого и последнего образца в каждой лунке 96-луночного планшета. После 15-минутной процедуры встряхивания гликаны элюи-ровали 2 х 100 мкл сверхчистой воды при комнатной температуре, объединенные элюаты хранили при —20° до момента использования. Если в качестве неподвижной фазы использовали биогель, в каждую лунку дополнительно добавляли 75 мкл сверхчистой воды, перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре, элюировали и объединяли с двумя первыми элюатами.
Устойчивость метод
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.