ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 5, с. 366-384
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
УДК 575.16:595.773.4
ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОМНЫХ РАЙОНОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ЭКСПРЕССИЮ lawc/Trf2 В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ D. MELANOGASTER
© 2012 г. О. Б. Симонова1, Е. А. Модестова2, Ю. Е. Воронцова1, Р. О. Черезов1
1 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26
2 Институт биологии гена РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 34/5 E-mail: osimonova@hotmail.com Поступила в редакцию 11.07.11 г.
Окончательный вариант получен 31.01.12 г.
Мутации leg-arista-wing complex (lawc) нарушают экспрессию белка дрозофилы, гомологичного базовому фактору транскрипции человека TBP (TATA-box binding protein) Related Factor 2 (TRF2), специфически контролирующего развитие. Впервые проведён генетический скрининг различных областей генома с целью выявления межгенных взаимодействий lawc/Trf2 с другими генами и геномными районами, для чего применялась коллекция линий Deficiency Kit с делециями, в сумме перекрывающими значительную часть генома. В результате генетического картирования были выявлены 26 цитологических зон, делеции которых вызывают либо гибель особей, либо модификацию мутантного фенотипа, вызванного пониженной экспрессией белка TRF2. Эти делеции можно использовать в дальнейшем для выявления как новых генов-мишений белка TRF2, так и его позитивных или негативных регуляторов. Известно, что в процессе клеточной дифференцировки TRF2 может входить в состав высокомолекулярных комплексов, содержащих фактор, контролирующий репликацию хромосом DREF и компоненты хроматин-ремодулирующего комплекса NURF. В данной работе установлены новые генетические взаимодействия lawc/Trf2 c рядом генов, кодирующих базовые и специфические факторы транскрипции. В подавляющем большинстве нарушение этих взаимодействий вызывает дефекты развития и гибель особей. Однако в случае с геном e(y)1, кодирующем фактор транскрипции Taf9, его взаимодействие с lawc/Trf2 ограничено репродуктивной системой самцов. Мутантные самцы lawcp1e(y)1u1 становятся стерильны из-за нарушения созревания сперматоцитов первого порядка и недостаточной премейотической конденсацией хромосом клеток полового пути.
Ключевые слова: делеция, аутосома, цитологическая карта, экспрессивность, пенетрантность, генетический скрининг, гаплонедостаточность, фактор транскрипции, сперматогенез, Бго8орНИа теШп-ogaster.
ВВЕДЕНИЕ
Процесс индивидуального развития организма сопровождается активацией конкретных сигнальных путей, которые включают различные программы клеточной детерминации и дифференцировки. Для выявления эволюционно-кон-сервативных генов-участников сигнальных путей и характеристики их специфических функций применяют генетические скрининги, выполненные на плодовой мушке Drosophila melanogaster, которая является объектом, удобным для такого рода поиска, и широко используется для детального исследования многих иерархически консервативных механизмов. Скорость, с которой осуществляется направленный скрининг компонентов сигнальных путей при работе с дрозофилой, является одним из самых мощных преимуществ этого модельного объекта перед другими. Прин-
цип скрининга заключается в выявлении локу-сов, нарушение экспрессии которых специфически модифицируют определенный мутантный фенотип. При таком подходе используют восприимчивый генетический фон, который слабо выражен, но легко заметен (например, "грубоватые" глаза, небольшая вырезка крыловой пластинки). Поиск мутаций на слабовыраженном генетическом фоне позволяет обнаружить транс-действующие регуляторные факторы, например, гены-энхансеры, если мутация усиливает фенотипиче-ское проявление, либо гены-супрессоры, если происходит ослабление фенотипа.
С целью выявить возможные межгенные взаимодействия скрещивают дрозофил из двух лабораторных линий, несущих мутации по разным генам. Обычно такие скрещивания проводят, предполагая, что исследуемые гены участвуют во
взаимосвязанных процессах. При этом не будут выявлены взаимодействия, о которых ничего неизвестно, или же взаимодействия с генами, мутации по которым еще не описаны или недоступны.
Другой, более масштабный, но менее точный способ поиска межгенных взаимодействий — де-леционное картирование. Строго говоря, это один из старых методов, получивших новое развитие в рамках проектов по картированию генома дрозофилы. Из множества делеций составляется так называемый Deficiency Kit — минимальное количество делеций, затрагивающих наибольшую часть генома Drosophila melanogaster. В настоящей работе мы используем Bloomington Deficiency Kits (DF2 и DF3), по последним данным его полный набор составляют 238 линий, что соответствует от 85 до 91% полос на карте политен-ных хромосом.
В последнее время создана система делецион-ного картирования с гораздо большим разрешением, так называемые Exelixis Deficiencies (Parks et al., 2004). Геном дрозофилы насыщался инсер-циями трансгенных конструкций на основе Р-элемента, включавших последовательности сайт-специфичной рекомбинации. С помощью рекомбиниции между такими конструкциями можно получать делеции с четко устанавливаемыми границами (Thibault et al, 2004). Линии имеют изогенное происхождение и перекрывают чуть более 50% генома. Районы, по которым в принципе невозможно получить делеции из-за летальности гетерозиготных особей (гаплонедо-таточности), минимизируются тщательным подбором изначально полученных инсерций.
Мутация leg-aristae-wing complex (lawcp1) проявляла варьирующую экспрессивность. При сильной экспрессивности мутантов характеризуют расставленные, приподнятые, обрезанные крылья; дополнительные щетинки на голове, груди и щитке; "грубоватые" глаза; более того, нарушалась сегментация ног и ариста трансформировалась в тарзус (Симонова и др., 1992; Симонова, 2000). Со временем экспрессивность мутации резко снизилась (изменения ограничиваются лишь дополнительными щетинками). Слабый фенотип послужил отличным фоном для поиска генов, мутации которых либо приводят к восстановлению утраченных признаков фенотипа lawc, либо становятся гаплонедостаточными леталями в комбинации с аллелем lawcp1.
Последние исследования показали, что мутация lawc вызывает снижение уровня экспрессии фактора транскрипции, который гомологичен белку TRF2 человека (Копытова и др., 2005). Этот белок принадлежит семейству TBP-подобных белков, являющихся альтернативными факторами базовой транскрипции (Rabenstein et al., 1999).
Процесс транскрипции у эукариотических организмов осуществляют PKK-полимеразы. Для того чтобы PKK-полимераза связалась с промотором гена, необходимо присутствие большого числа белковых факторов транскрипции. Считается, что основным и универсальным фактором базовой транскрипции является белок ТВ^ связывающийся с коровой последовательностью ТАТА, входящей в состав большинства промоторов. Совсем недавно были обнаружены еще три гена, продукты которых имеют структурное сходство ДНK-связывающего домена и, как полагают, выполняют схожую функцию, проявляя при этом некоторую тканевую специфичность. Это гены TBP related factor 1, 2 и 3 ( Trf1 и Trf2, Trf3). Интересно, что в геноме дрожжей есть только один ген этого семейства — Tbp. У дрозофилы их три: Tbp, Trf1 и Trf2. У человека нет гена Trf1, но наряду с Tbp и Trf2 присутствует другой гомолог — Trf3 (Persengiev et al., 2003)
В отличие от TBP, TRF2 входит в состав высокомолекулярного комплекса (500 кДа) и следовательно, может быть ассоциирован с набором белков, которые отличаются от TВP- и TRF1-ассо-циированных факторов. Были идентифицированы TRF2-содержащие комплексы дрозофилы, в состав которых входят компоненты хро-матин-ремодулирующего комплекса NURF (Nu-cleosome Remodelling Factor), белка DREF (DNA Replication-related Element (DRE)-binding Factor), а также другие белки, которые могут взаимодействовать с хроматином (Hochheimer еt al., 2002). Биохимический анализ TRF2-содержащего комплекса дрозофилы выявил некоторые TRF2^to-цифичные промоторы. Исследования in vitro показали, что DREF-содержащий TRF2-комплекс участвует в распознании промотора гена PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Анализ экспрессии генов выявил несколько дополнительных ге-нов-мишений TRF2, вовлеченных в репликацию ДНK и клеточную пролиферацию, которые содержат элемент DRE (Hochheimer еt al., 2002). Однако генетических экспериментов позволяющих выявлять межгенные взаимодействия с участием гена Trf2 in vivo не проводилось, в силу отсутствия его жизнеспособных мутаций. Единственной мутацией, нарушающей уровень экспрессии TRF2, оказалась мутация lawcp1. В предыдущих исследованиях мы установили ряд генов Х-хромосомы, мутации которых усиливают lawc-фенотип: cut (Симонова и др., 1992), scute (Симонова и др., 1996), zeste (Симонова и др., 1998). Аутосомные мутации практически не исследовались.
В данной работе проведены крупномасштабные генетические эксперименты по скринирова-нию генома дрозофилы, с целью обнаружить другие гены, с которыми может взаимодействовать lawc/Trf2 в различных клетках, тканях и органах в
процессе развития. В результате были выявлены 14 "летальных" цитологических зон, содержащих локусы, возможно, участвующих с геном lawc/Trf2 в одних и тех же процессах. Кроме того, мы провели поиск взаимодействий lawcp1 с рядом мутаций генов, кодирующих основные компоненты (транскрипционные факторы, TF), участвующие в базовой транскрипции. Обнаружены генетические взаимодействия lawc/Trf2 c генами, кодирующими субъединицы базового фактора транскрипции TFnH и ряда факторов, ассоциированных с белком TBP (TBP associated factors — TAFs).
Более того, было изучено взаимодействие lawc/Trf2 с генами группы enhancer of yellow (e(y)1, 2, 3). Гены этой группы кодируют факторы, являющиеся компонентами белковых комплексов, регулирующих эффективность транскрипционного процесса, осуществляемого РНК-полимера-зой II (Soldatov et. al., 1999; Georgieva et. al., 2001; Shidlovskii et. al., 2005). Ранее было показано, что продукты генов Taf9/e(y)1 и e(y)2 взаимодействуют между собой (Georgieva et. al., 2001). Мы установили, что мутации этих генов на фенотип lawcp1 не влияют. Однако самцы l
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.