ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 699-706
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЫЯВЛЕНИЕ ЛЕКТИНОВ ОБОЛОЧКИ ПЫЛЬЦЕВОГО ЗЕРНА Nicotiana tabacum, СТИМУЛИРУЮЩИХ ПРОРАСТАНИЕ in vitro
© 2007 г. Н. П. Матвеева, Е. А. Лазарева, Т. П. Клюшник, С. А. Зозуля, И. П. Ермаков
Кафедра физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 21.09.2006 г.
Обнаружено, что белки, диффундирующие из пыльцевых зерен табака в окружающую среду в условиях блока их активации холодом (0°С), стимулируют прорастание пыльцы in vitro. В результате фракционирования этих белков методом аффинной хроматографии с использованием a-D-ме-тил-маннопиранозида (ММП), иммобилизованного на агарозе, выделены лектины, стимулирующие прорастание. По данным ДДС-электрофореза в ПААГ, их мол. м. составили 58, 69 и 74 кД. Стимулирующий эффект этих лектинов был обусловлен специфическим взаимодействием с углеводными детерминантами, поскольку конкурентный сахар (0.3 М ММП) полностью подавлял действие лектинов на прорастание. Наряду с этим в числе белков-диффузатов оболочки обнаружены поливалентные лектины, способные агглютинировать эритроциты. Эти лектины представляют собой гли-копротеины с Глю/Ман углеводными детерминантами. Их способность к гемагглютинации не изменялась в присутствии ММП, что позволяет предполагать наличие в оболочке пыльцевого зерна различных по углеводной специфичности лектинов.
Nicotiana tabacum - пыльцевое зерно - прорастание - оболочка - лектины
ВВЕДЕНИЕ
Начальный этап прорастания пыльцевого зерна покрытосеменных растений включает его ре-гидратацию и активацию метаболических процессов, которые обеспечивают последующее формирование и быстрый рост пыльцевой трубки в направлении зародышевого мешка, где и происходит оплодотворение [1]. В первые минуты контакта с поверхностью рыльца (или любой влажной средой) пыльцевое зерно выделяет в окружающую среду белки и пептиды, диффундирующие из оболочки и липофильного слоя, покрывающего оболочку (трифины или полленкит-та) [2]. По мере активации пыльцевое зерно начинает выделять вещества, продуцируемые протопластом. В числе белков, выделяемых пыльцевым зерном, выявлены разнообразные ферменты, в-экспансины, а также белки и пептиды, контролирующие процессы узнавания и гид-
Сокращения: КонА - конканавалин А, ММП - а^-метил-маннопиранозид.
Адрес для корреспонденции: Лазарева Екатерина Алексеевна. 119899 Москва, Воробьевы горы, Московский государственный университет, биологический факультет, кафедра физиологии растений. Факс: 007 (495) 939-43-09; электронная почта: plantphys@biophys.msu.ru
ратации пыльцевого зерна и рост пыльцевой трубки [1, 3].
До настоящего времени остается открытым вопрос о наличии в оболочке пыльцевого зерна лектинов - белков, которые специфически взаимодействуют с углеводами, но не модифицируют их и не являются антителами [4]. В молекуле лек-тина может быть один или несколько центров связывания углеводных детерминант [4]. В последнем случае лектины, сшивая гликоконъюга-ты, могут образовывать трехмерные сети, что позволяет выявлять их в тестах преципитации или клеточной агглютинации, если соответствующие гликоконъюгаты иммобилизованы на поверхности клеток [5]. Лектины играют важную роль в контроле внутриклеточных транспортных процессов и межклеточных взаимодействий как у животных, так и у растений [4, 5].
С использованием теста гемагглютинации лектины обнаружены в гомогенатах пыльцевых зерен самых разных групп растений [2, 6-8]. Однако в этих работах, как правило, речь шла либо о совокупности всех клеточных белков, либо о лектинах, достаточно прочно связанных с оболочкой.
Ряд данных позволяет предполагать существование функционально значимых лектинов, диффундирующих из оболочки пыльцевого зерна на начальном этапе прорастания. Эти работы мож-
но подразделить на две группы. Первая группа объединяет исследования роли пыльцевых диф-фузатов во взаимодействиях пыльцевых зерен с поверхностью рыльца и между собой. Блокирование гликоконъюгатов рыльца некоторых растений (злаки, Brassica, Gladiolus) лектином конкана-валином А (КонА) подавляло адгезию пыльцевых зерен [2]. В ранних работах обсуждалось участие лектин-подобных компонентов пыльцевого зерна в реализации механизма самонесовместимости, однако эта гипотеза не получила подтверждения в более поздних работах, выполненных с использованием методов молекулярной биологии [9]. При исследовании пыльцы большой группы аллергенных растений (люцерны, кукурузы, ежи и др.) показали [10], что пыльцевые диффу-заты вступают в реакцию преципитации с КонА, тем самым, обнаруживается присутствие гликопро-теинов с Глю/Ман углеводными детерминантами. Вместе с тем, белковые диффузаты давали преципитацию друг с другом в определенных межвидовых комбинациях. Поскольку эти реакции специфически подавлялись моно- или дисахаридами, авторы делают вывод о наличии в пыльцевых диффузатах подвижных лектинов и гликопротеи-нов. Последний вывод подтвержден многочисленными данными [11, 12].
Вторая группа работ включает исследования действия экзогенных лектинов на прорастание пыльцевого зерна. Southworth [13] показала, что добавление экзогенных лектинов КонА или фи-тогемагглютинина в суспензионную культуру пыльцевых зерен лилии стимулировало прорастание, сокращая лаг-период. Согласно нашим данным [14], на начальном этапе активации пыльцевых зерен табака КонА вызывал гиперполяризацию плазматической мембраны вегетативной клетки, сдвиг величины внутриклеточного рН и, как следствие, стимулировал прорастание. Эти данные в совокупности демонстрируют присутствие на наружной поверхности плазматической мембраны или в оболочке клеток рыльца и/или пыльцевого зерна гликоконъюгатов, которые, образуя комплекс с экзогенным лектином, влияют на прорастание. В связи с этим можно предположить, что в процессе гидратации и активации пыльцевого зерна из его оболочки диффундируют эндогенные лектины, сходные с КонА по сродству к углеводным детерминантам, и способные, подобно этому лектину, стимулировать прорастание.
В задачи настоящей работы входила проверка этой гипотезы. С этой целью исследовали легко-вымываемые белки-диффузаты оболочки пыльцевого зерна табака. В результате были выделены лектины, стимулирующие прорастание.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Растения табака Nic-otiana tabacum L. сорта Petit Havana SR1 выращивали из семян в климатической камере (25°C, 16-часовой световой день) на вермикулите ("C-верад AÉPO", Россия), используя для полива раствор минеральных солей [15]. Пыльники извлекали из цветков накануне их раскрывания и помещали для дозревания в термостат (25°C) на двое суток. Пыльцу собирали из раскрывшихся пыльников и хранили при -20°C. Перед проращиванием ее размораживали и выдерживали во влажной камере (2 ч, 25°C).
Получение диффузатов из стенок пыльцевых зерен. Размороженные пыльцевые зерна промывали диэтиловым эфиром для удаления липо-фильных покровных материалов (трифины), подсушивали на воздухе, увлажняли во влажной камере (2 ч, 25°C), и суспендировали в охлажденном до 0°C элюирующем буфере (1.6 hM H3BO3, 3 hM Ca(NO3)2, 0.8 mM MgSO4 и 1 mM KNO3 в 25 mM Mes-Трис-буфере, pH 5.9) в соотношении 150 мг пыльцы на 1 мл среды. Полученную суспензию инкубировали в течение 15 мин при периодическом перемешивании при 0°C, чтобы блокировать процесс активации пыльцевого зерна и исключить возможность экскреции белков протопласта (аналогичный подход использован в работах [16, 17]). В предварительных экспериментах с использованием общепринятого флуоресцентного теста [18] было установлено, что после такого воздействия пыльцевые зерна сохраняют свою жизнеспособность (данные не приводятся). По завершении инкубации пыльцевые зерна удаляли фильтрацией через капроновый (11 мкм, "Millipore", CШA), а затем мембранный (0.22 мкм, "Millipore") фильтры. K раствору диффузатов добавляли ингибиторы протеаз (Protease Inhibitor Cocktail, "Sigma", CШA) из расчета 5 мкл/мл. Полученные растворы диффузатов хранили в замороженном состоянии при -20°C.
Гемагглютинация. Для выявления лектиновой активности в пробах диффузатов использовали общепринятый метод гемагглютинации с эритроцитами кролика [19]. Предварительно к пробе добавляли NaCl до конечной концентрации 0.15 M, рH доводили до 7.4. При взятии крови в качестве антикоагулянта использовали 27 mM цитратный буфер ^H 7.5) с добавлением 0.15 M NaCl. Эритроциты отмывали центрифугированием (200 g, 4°C, 5 мин) в трех порциях 20 mM K-фосфатного буфера ^H 7.4) c 0.15 M NaCl и переносили для хранения в среду, содержавшую 27 mM цитрат натрия, 0.1 M D-Глю, 0.15 M NaCl, рH 7.5. Перед использованием эритроциты переводили в среду того же солевого состава, что и подготовленная проба диффузатов.
Реакцию агглютинации проводили в иммунологических плашках с U-образными лунками, используя серии двукратных разведений исследуемых проб. В лунке смешивали 10 мкл 8%-ной суспензии эритроцитов и 50 мкл тестируемой белковой пробы. В качестве положительного контроля использовали 5 мкг/мл КонА, в качестве отрицательного (на аутоагглютинацию) -солевой раствор того же состава, что и в белковых пробах. Степень агглютинации оценивали визуально по прошествии 1 ч.
Выявление углеводной специфичности пыльцевых лектинов в реакции агглютинации. Использованы следующие сахара: 50 мг/мл декстран (40000), 100 мМ растворы ММП (a-D-метил-ман-нопиранозид), D-глюкозы, L-арабинозы, D-га-лактозы, L-рамнозы, сахарозы, лактозы и раффинозы. Диффузаты (100 мкг белка/мл раствора) инкубировали с соответствующими углеводами в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего добавляли суспензию эритроцитов, по прошествии еще 1 ч оценивали лектиновую активность.
Выявление гликопротеинов в составе лектинов оболочки. В первой серии экспериментов к растворам диффузатов в серии двукратных разведений (от 800 до 50 мкг/мл) добавляли КонА (5 мкг/мл) и инкубировали их в течение 1 ч, после чего оценивали лектиновую активность этих растворов указанным выше способом.
Во второй серии экспериментов гликопротеи-ны удаляли из
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.