научная статья по теме ВЫЯВЛЕНИЕ НУЛЬ-АЛЛЕЛЕЙ В МИКРОСАТЕЛЛИТНОМ ЛОКУСЕ КЕТЫ (ONСORHYNСHUS KETA WALBAUM) Биология

Текст научной статьи на тему «ВЫЯВЛЕНИЕ НУЛЬ-АЛЛЕЛЕЙ В МИКРОСАТЕЛЛИТНОМ ЛОКУСЕ КЕТЫ (ONСORHYNСHUS KETA WALBAUM)»

ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 8, с. 1143-1147

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 575.174.015.3:597.553.2

ВЫЯВЛЕНИЕ НУЛЬ-АЛЛЕЛЕЙ В МИКРОСАТЕЛЛИТНОМ ЛОКУСЕ

КЕТЫ (Oncorhynchus keta Walbaum)

© 2010 г. С. Ю. Кордичева, Г. А. Рубцова, М. В. Шитова, Г. О. Шайхаев, К. И. Афанасьев, Л. А. Животовский

Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Москва 119991

e-mail: kordicheva@rambler.ru, levazh@gmail.com Поступила в редакцию 08.02.2010 г.

В популяционных исследованиях с использованием микросателлитных маркеров встречаются так называемые нуль-аллели — отсутствие ПЦР-продукта, вызванное мутациями во фланкирующих микросателлит последовательностях ДНК, на которую гибридизуются праймеры. Это приводит к тому, что микросателлитный аллель, сцепленный с такой мутацией, не амплифицируется, приводя к проявлению ложной гомозиготности у гетерозиготных особей, что влечет за собой смещение по-пуляционно-генетических оценок, в том числе избыток гомозигот по микросателлитным локусам. Исследуя популяционную структуру тихоокеанского лосося-кеты (Onrnrhy^hus keta Walbaum), обнаружили нуль-аллели по микросателлитному локусу Oke3 в тех выборках кеты, в которых наблюдался избыток гомозигот. Для этого были использованы разные комбинации модифицированных праймеров, подобранных к локусу Oke3, применение которых позволило выявить истинные гетеро-зиготы среди тех особей, которые были прежде диагностированы с использованием стандартной пары праймеров как гомозиготы. Исключение нуль-аллелей ликвидировало избыток гомозигот в указанных выборках кеты. Помимо исключения ложной гомозиготности, использование модифицированных праймеров позволяет ввести в популяционные исследования полиморфные варианты праймерной области, сцепленные с определенными микросателлитными аллелями.

Тихоокеанский лосось-кета (Опсогкупскт к&а ^УЬаит) имеет большое промысловое значение и является важным элементом продовольственной безопасности России. Изучение генетического состава популяций кеты важно не только для решения фундаментальных научных проблем, например такой, как популяционная организация вида, но и для формирования представления о том, как лучше сохранять, поддерживать и воспроизводить этот вид, а также как оптимизировать процессы рыбоводства и рыболовства. Актуальным на данный момент является изучение популяционной структуры разных видов с помощью микросателлитных маркеров. Микросателлиты обладают высоким полиморфизмом и хорошо дифференцируют популяции [1, 2]. На данный момент уже проведены большие исследования по микросателлитной изменчивости кеты и показано, что микросател-литные маркеры являются хорошими маркерами для исследования межпопуляционных различий этого вида [3—5].

При проведении широкомасштабных популя-ционных исследований на разных видах животных исследователи сталкиваются с проблемой нуль-аллелей. В популяционных исследованиях нуль-ал-лелем принято называть явление отсутствия ПЦР-продукта, которое вызвано мутациями (единичная замена, инсерция, делеция, инверсия) во фланкирующих микросателлит последовательностях

ДНК, на которую гибридизуются праймеры. Это приводит к некорректной интерпретации популяционных данных [6], создавая "фальшивые" гомозиготы вместо гетерозигот и увеличивая тем самым уровень наблюдаемой гомозиготности, что тестируется отклонением от равновесия Харди—Вайн-берга. Например, при изучении популяций японского гребешка (Chlamysfarreri) по большому числу микросателлитных локусов было показано экстремально высокое количество нуль-аллелей — 56.2% локусов, что вызвало сильные искажения в объяснении популяционной структуры этого вида [7]. При исследовании популяций пятнистого (Cervus nippon) и благородного (C. elaphus) оленей Шотландии по 22 микросателлитным локусам в пяти локусах были выявлены нуль-аллели, причем только в популяциях пятнистого оленя [8]. Интересным примером выявления нуль-аллеля является популяционное исследование, проведенное на обыкновенном кулике-сороке (Haematopus ostrale-gus), где при увеличении выборки с 230 до 378 особей в одном из семи исследуемых микросателлитных локусов был выявлен нуль-аллель [9]. Также были обнаружены нуль-аллели в популяциях долгоносика (Pissodes strobi) [10], европейского анчоуса (Engraulis encrasicolus) [11], осьминога (Octopus vulgaris) [12] и других видов животных и растений [6, 10]. Следует заметить, что нуль-аллели встречались и в исследованиях полиморфизма аллозим-

1144

КОРДИЧЕВА и др.

Рис. 1. Последовательность локуса ОкеЗ [14]. Жирным курсивом выделено тело микросателлита, строчными буквами — стандартные праймеры.

61 ОСКТПДЛС АС ГЛ( 1ГГЛТГГГГ1АГАГГ АГ ГПДЫК'Д I (.'( ¡Л(К."1 .ЛАД С :) с ^ i: I ;>. ;i 121^ a;;'. l l' I (.' I' ] Ci I If II 1 (.' 1С 'AC' l'(.' 1 1'Л С'A(' П I (i A.M. i TCCCTCTCdT (."¡'(ТСССТСЧ' 181 (47 ПТСТССС • 1CTCGK IC! CCdX K (, l ( ■ ! ( a ( С ТСТС (, I X IX/XCCI XiC(, TCTCTC 241

301 C'KIAAAOU.'A (;c;t.r(, lie; l(.(i Ki-YIAJC IA Г1 ПГАСААЛ 1 (i-K'lAAAl'AC l ;i с I al L l n и 361 I ;> с ;i l :i HJ с с : ^Л ITCTUrl' П If 1С К I ( ' I ГЛ1Г.С

ных маркеров, где они проявлялись отсутствием энзиматической активности, и могут встретиться при исследованиях иных типов полиморфизма ДНК.

Так как еще не разработаны надежные способы определения и учета данного явления, во многих исследованиях те локусы, в которых предположительно выявляются нуль-аллели, исключаются из популяционного анализа [13]. Однако такой путь решения проблемы неприемлем при масштабных исследованиях, поскольку в дальнейшем при увеличении самой выборки или расширении исследуемых популяций возрастает вероятность появления нуль-аллеля на каждый ло-кус, что может привести к исключению большого числа локусов, а это отрицательно сказывается на качестве исследований. Причем в одной популяции одного вида он может проявляться, а в другой популяции — нет.

Одним из локусов, попадающих под "подозрение" на наличие в нем нуль-аллеля при крупномасштабном исследовании популяций кеты, является ОкеЗ [14]. По этому локусу были выявлены достоверные отклонения от равновесия Харди— Вайнберга в сторону увеличения гомозигот в ряде популяций кеты островов Сахалин, Кунашир и Итуруп (наши неопубликованные данные).

Отклонение от равновесия Харди—Вайнберга может появляться по разным причинам: отбор, действующий на данный локус, инбридинг, смесь нескольких популяций, в которых различаются частоты аллелей, или наличие нуль-аллеля. Гипотеза о действующем на этот локус отборе была отвергнута, так как микросателлитные локусы считаются селективно нейтральными. Возможность инбридинга исключается, иначе отклонения от равновесия Харди—Вайнберга наблюдались бы по всем исследуемым локусам. Гипотеза смешения популяций (эффект Валунда) нами была поставлена под сомнение, так как в исследуемых ранее популяциях кеты наблюдались слишком сильные отклонения от равновесия Харди—Вайнберга, чтобы объясняться имеющейся относительно невысокой локальной генетической диф-

ференциацией кеты. Поэтому мы остановились на гипотезе о наличии нуль-аллеля в локусе ОкеЗ и провели необходимые молекулярно-биологи-ческие исследования. Известно, что в судебной медицинской практике во избежание артефактов и ложной гомозиготности, вызванных наличием нуль-аллелей, советуют использовать несколько пар праймеров [13]. Этим подходом мы решили воспользоваться для выявления нуль-аллеля.

Локус ОкеЗ (рис. 1) включает в себя несколько идентичных повторов (мотивов), состоящих из 13 нуклеотидов (TCCCTCTCGTCTC) [14] и фланкирующих этот микросателлит нуклеотид-ных последовательностей (по терминологической классификации — это минисателлит, так как длина мотива превышает шесть нуклеотидов [1], однако характер популяционной изменчивости серии тандемных повторов одинаков как для коротких, так и для длинных мотивов, и в этом смысле мы относим Оке3 к микросателлитным локусам). По этому локусу у кеты с использованием праймеров, синтезированных согласно опубликованным данным [14] (далее "стандартные" праймеры), было обнаружено 12 аллельных вариантов.

Цель настоящей работы — подбор праймеров (далее "модифицированные" праймеры), с помощью которых можно было бы выявить нуль-аллели, и подбор условий для прохождения ПЦР.

В исследовании использовались образцы ткани кеты, зафиксированные в 96%-ном этаноле, собранные в 2003—2007 гг. на островах Сахалин, Итуруп, Кунашир во время нерестового хода. Взятие проб было организовано как на естественных нерестилищах, так и с лососевых рыбоводных заводов [4]. Тотальную ДНК выделяли по стандартной методике с помощью набора реактивов Diatom DNA Prep 200 ООО "Лаборатория Изоген".

Для выявления нуль-аллеля микросателлитно-го локуса Оке3 были отобраны выборки с сильным отклонением от равновесия Харди—Вайнберга и из них выбраны образцы, которые при использовании стандартных праймеров на электрофоре-

ВЫЯВЛЕНИЕ НУЛЬ-АЛЛЕЛЕЙ В МИКРОСАТЕЛЛИТНОМ ЛОКУСЕ КЕТЫ

1145

грамме вели себя как гомозиготы, проявляясь одной полосой. Для поиска нуль-аллелей были подобраны различные варианты праймеров, представленные в табл. 1.

Для ПЦР использовали набор реагентов GenePak PCR Core ООО "Лаборатория Изоген", содержащий ингибированную для "горячего старта" Taq-ДНК полимеразу, дезоксинуклеозид-трифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 u, 200 мкМ и 2.5 мМ, а также оптимизированную буферную систему. Конечная концентрация праймеров в реакции 0.1—0.5 мкМ, количество ДНК 50—100 нг. Амплификацию микросателлитного локуса Üke3 проводили в термоциклере Applied Biosystems 9800 Fast Thermal Cycler при следующем режиме: предварительная денатурация ДНК — 95°C, 5 мин; восемь циклов: плавление — 94°C, 1 мин; отжиг праймеров, синтезированных согласно опубликованным данным, — 54°C, 30 с; отжиг модифицированных праймеров — 56°C, 30 с; синтез ДНК — 72°C, 30 с; затем следовал 21 цикл, включающий: плавление — 94°C, 30 с; отжиг праймеров, синтезированных согласно опубликованным данным, — 54°C, и отжиг модифицированных праймеров - 56°C, 30 с, синтез ДНК - 72°C, 15 с.

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6%-ном неденатурирующ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком