научная статья по теме ВЫЗВАННЫЙ ESCHERICHIA COLI ДЫХАТЕЛЬНЫЙ ВЗРЫВ У НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА, ПРАЙМИРОВАННЫХ РАЗНЫМИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЫЗВАННЫЙ ESCHERICHIA COLI ДЫХАТЕЛЬНЫЙ ВЗРЫВ У НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА, ПРАЙМИРОВАННЫХ РАЗНЫМИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДАМИ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 6, с. 442-450

УДК 612.112.3.062:612.112.91

ВЫЗВАННЫЙ Escherichia coli ДЫХАТЕЛЬНЫЙ ВЗРЫВ У НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА, ПРАЙМИРОВАННЫХ РАЗНЫМИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДАМИ

© 2007 г. И. Р. Прохоренко, Е. В. Золотущенко, Н. Ю. Тарасевич, Н. В. Авхачева*,

В. Г. Сафронова*, С. В. Грачев

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 Пущино Моск. обл.; факс: (496) 7330533; электронная почта: isabella03@rambler.ru *Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино Моск. обл.; факс: (496) 7330509; электронная почта: safronova@icb.psn.ru Поступила в редакцию 06.04.2007 г.

После доработки 09.07.2007 г.

При грамотрицательном сепсисе возникает опасность развития эндотоксинового шока, вызываемого попаданием свободных эндотоксинов в кровь. Фундаментальной и клинической проблемой является поиск антагонистов, способных блокировать токсические эффекты эндотоксинов. Ведущую роль в защите организма от патогенов играют нейтрофилы. В экспериментах in vitro нами исследовано влияние праймирования нейтрофилов эндотоксином из Escherichia coli (LPS^o) и нетоксичным, блокирующим эффекты эндотоксинов, липополисахаридом из Rhodobacter capsulatus (LPSRbcaps.) на дыхательный взрыв, активированный бактериями E. coli K-12, опсонизированными аутологичной сывороткой. Предварительная инкубация нейтрофилов с каждым из липополисахаридов в разной степени усиливала продукцию активных форм кислорода (АФК) в ответ на добавление бактерий. Инкубация клеток последовательно сначала с LPSRbcaps., а затем с LPSEcoli практически отменяла эффекты каждого из них. Эти результаты указывают на потенциальную возможность использования LPSRbcaps. для предупреждения эффектов эндотоксинов.

Основным рецептором миелоидных клеток, узнающим и связывающим эндотоксины (липопо-лисахариды, LPS), является белок CD14 [1, 2]. Предполагается, что CD14 служит лиганд-фокуси-рующей молекулой для другого трансмембранного белка - TLR4, который запускает механизмы трансмембранной передачи сигнала, перестройку цитоскелета и фагоцитоз. Важную роль в доставке LPS к рецепторам CD14 играет белок плазмы, связывающий липид A (LBP) [3]. LBP действует как опсонин, а CD14 как рецептор к опсонину, что обеспечивает фагоцитоз бактерий или частиц, покрытых LPS [4]. Обнаружено, что в моноцитах наряду с классическими путями фагоцитоза реализуется фагоцитоз, зависимый от CD14, механизм, которого отличается от механизма комплемент-зависимого фагоцитоза. В частности, показано, что экспрессия рецепторов CD14 на клетках моно-цитарной линии ТНР-1, исходно не имеющих на своей поверхности CD14, сопровождается усилением фагоцитоза бактерий Escherichia coli, предварительно опсонизированных белками сыворотки [5]. Основываясь на результатах по ингибирова-

Сокращения: LPS - липополисахарид; АФК - активные формы кислорода; fMLF - хемотаксический пептид N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; TLR4 - Toll-like receptor-4 (Толл-подобный рецептор-4); LPB - LPS-связывающий белок.

нию фагоцитоза моноклональными антителами к CD18- (CR3 в-цепь и CR4b в-цепь) и к Fcy-рецеито-рам (CD16, CD32, CD64), авторы заключили, что эти рецепторы не кооперируются с CD14 в процессе активации фагоцитоза [6]. Используя антитела к CD14 и к LBP, Шифф и др. [6] показали, что CD14-зависимый фагоцитоз является самостоятельным процессом, отличным от CD^^sh^-мой активации клеток, приводящей к синтезу про-воспалительных цитокинов [7]. В настоящее время известны LPS, которые, связавшись с рецептором, не только не активируют клетку, но и ингибируют эффекты токсических LPS, проявляя тем самым антагонистическую активность в отношении эндотоксинов. Наиболее исследованными среди них являются LPS из фототрофных бактерий семейства Rhodobacter [8]. Показано, что антагонисты ослабляют усиливающее действие эндотоксинов на дыхательный взрыв нейтрофилов, индуцированный fMLF [9], блокируют экспрессию CD11b (а-цепь CR3) в мембранах нейтрофилов в ответ на эндотоксины [10], подавляют синтез провоспалитель-ных цитокинов, индуцированный эндотоксинами [11].

Полиморфно-ядерные нейтрофильные грану-лоциты (нейтрофилы) - наиболее многочисленные лейкоциты крови человека. Нейтрофилы обеспечивают быстрые реакции иммунной систе-

мы на инородное вторжение. Бактерицидная функция клеток включает поглощение патогена, его деструкцию с помощью фагосомальных ферментов, а также интенсивный выброс супероксидного анион-радикала, предшественника других активных форм кислорода (АФК). Считается, что при активации нейтрофилов АФК прямо участвуют в деструкции бактерий [12, 13]. Массированный выброс АФК при активации фагоцитов получил название "дыхательный взрыв". Его развитие связано с активацией мембранного фермента NADPH-оксидазы, который формируется из ци-топлазматических и мембранных субъединиц, и представляет собой систему транспорта электрона [14]. Генерация супероксида NADPH-оксидазой при фагоцитозе считается критичной для устойчивости организма к бактериальной и грибковой инфекции [13]. Однако эффективная инактивация бактерий при фагоцитозе может происходить и без участия NADPH-оксидазы и АФК [15 ].

Цель настоящей работы состояла в изучении влияния эндотоксина из E. coli и нетоксичного, блокирующего эффекты других эндотоксинов, LPS из Rhodobacter capsulatus на дыхательный взрыв, вызываемый у нейтрофилов бактериями E. coli, опсонизированными аутологичной сывороткой.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. В работе использовали люминол, среду Хенкса, хемотаксический пептид N-формил-Met-Leu-Phe (fMLF), LPS из E. coli О55:В5, фиколл ("Sigma", США), урографин ("Schering", Германия), лиофильно высушенные клетки E. coli K-12. LPS из Rb. capsulatus получали по модифицированной методике Вестфаля [16]. FITC-меченые бактерии E. coli K-12 получали по методу [17].

Получение нейтрофилов. Периферическую кровь здоровых доноров получали в клинических условиях и держали в стеклянных силиконизиро-ванных пробирках. Нейтрофилы выделяли с помощью метода дифференциального центрифугирования на двухслойном градиенте фиколла-урогра-фина (1.119 г/мл и 1.077 г/мл) по стандартной методике [18]. Чистота фракции составляла 9698%; жизнеспособность клеток, оцениваемая по окрашиванию трипановым синим, - 90-95%. Клетки содержали в номинально бескальциевой среде при 4°С и использовали через 1 ч после выделения.

Инкубирование нейтрофилов с бактериями E. coli K-12. Клетки E. coli (штамм K-12), предварительно опсонизированные термоинактивирован-ной аутологичной сывороткой, добавляли к нейтро-филам в среде Хенкса, содержащей 2% сыворотки [19]. Присутствие сыворотки в среде инкубации обеспечивало наличие LBP - белка, критически необходимого для взаимодействия LPS с нейтрофилами по

CD14-зависимому механизму [20]. В каждой пробе было 106 нейтрофилов; соотношение нейтрофилы : бактерии в пробе составляло 1 : 20. Для подтверждения поглощения бактерий нейтрофилами использовали FITC-меченые клетки E. coli K-12. Для тушения внеклеточной флуоресценции непоглощенных FITC-меченых E. coli использовали 0.4% раствор трипанового синего в PBS. Этот краситель не проникает в неповрежденные нейтрофилы, что позволяет определить количество поглощенных нейтрофилами бактерий.

Визуализацию поглощенных бактерий проводили с помощью конфокальной микроскопии по зеленому свечению (к = 524 нм) на приборе LSM 510 NLO Karl Zeiss (Германия) через 30 мин после добавления FITC-меченых клеток E. coli K-12 к нейтрофилам.

Праймирование нейтрофилов липополисаха-ридами. Клетки инкубировали с 10 нг/мл LPSEcoü или с 10 нг/мл LPSRbca„s. в измерительных ячейках в течение 30 мин при 37°С. С целью исследования совместного действия LPS Rbcaps. и LPSEcoü на продукцию АФК при фагоцитозе была выполнена серия экспериментов, в которых нейтрофилы инкубировали с LPSRbcaps. в течение 10 мин, затем к ним добавляли эндотоксин E. coli и инкубировали еще 20 мин, после чего добавляли опсонизированные бактерии E. coli K-12.

Регистрация хемилюминесценции. Интенсивность продукции АФК клетками оценивали по лю-минол-зависимой хемилюминесценции с помощью хемилюминометра ХЕМИЛЮМ-12, разработанного в ИБК РАН [21]. Регистрацию проводили при 37°С параллельно от 12 проб с частотой опроса 1/2.5 с. Одновременно готовили и размещали в приборе для измерений пробы с интактными клетками и клетками, обработанными 10 нг/мл LPSEcoü либо 10 нг/мл LPSRbcaps., либо последовательно LPSRbcaps. и LPSEcoü. Клетки инкубировали с LPS при постоянном перемешивании и одновременной записи интенсивности хемилюминесценции в течение 30 мин при 37°С, затем добавляли лиофильно высушенные клетки E. coli K-12 или 1 мкМ хемотаксический пептид N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) и в течение необходимого времени записывали ответ нейтрофилов.

Обработка результатов. Продукцию АФК рассчитывали как величину, пропорциональную площади под кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени при активации клеток бактериями или 1 мкМ fMLF (рис. 2, 3). Эффект оценивали по отношению суммарной продукции АФК клетками, обработанными LPS, к параметру интактных клеток, принятому за 100%. Данные приведены как среднее значение эффекта ± средняя квадратичная ошибка по указанному числу независимых измерений, каждое из которых выполнено на клетках одного человека. Достовер-

Рис. 1. Поглощение нейтрофилами FITC-меченых E. coli через 30 мин после добавления бактерий. а - Контрольные ней-трофилы; б - нейтрофилы, праймированные LPS_gco^; в - нейтрофилы, праймированные LPSr^ caps'; „ - нейтрофилы, праймированные последовательно LPSrj s и LPS_g соц.

i V4 V/ >f L ¿^jI „^^ВДМШВГ 5мкм 1 1

ность различий между группами устанавливали по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние липополисахаридов на фагоцитоз бактерий. На рис. 1 представлены микрофотографии поглощенных нейтрофилами FITC-меченых бактерий E. coli после 30-мин инкубации. Предварительная инкубация нейтрофилов с различными по составу и биологической активности LPS не влияла на поглощение ими бактерий.

Продукция активных форм кислорода нейтрофилами, праймированными липополисахари-дами. Фагоцитоз бактерий нейтрофилами сопровождается образование

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком