ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 485-487
УДК 547.963.1.02
ВЗАИМОДЕИСТВИЕ ФУКОЛЕКТИНА ОКУНЯ С ЛЬЮИСОВЫМИ АНТИГЕНАМИ
© 2004 г. В. Е. Пискарев*, Т. Л. Бушуева**, И. А. Ямсков*
*Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН, Москва 119991;
e-mail: piskarev@ineos.ac.ru **Институт экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра России, Москва 121552 Поступила в редакцию 27.05.2003 г.
Изучено взаимодействие фуколектина окуня Perca fluviatilis (PFL) с серией льюисовых антигенов по изменению его триптофановой флуоресценции. PFL связывался с Lec (Н тип 1)-пентасахаридом (Ka = 6.6 х 103 М-1) и Н тип 6-трисахаридом (Ka = 2.5 х 103 М-1), существенно слабее - с Le''-гексаса-харидом (Ka = 4.0 х 102 М-1), а Lea-, Lex-и Led-cодержащие олигосахариды c PFL не взаимодействовали. PFL относится к новому типу фуколектинов, узнающих Н-дисахарид Fuca1-2Gal в составе различных антигенов, в том числе в Н тип 1/2 и Leb.
L-Фукоза является важнейшим компонентом ряда углеводных антигенов, в частности групповых антигенов крови ABH(O), а также льюисовых антигенов - Lea, Lex, Leb и Ley [1]. Их узнавание осуществляется фукозоспецифичными лек-тинами, или фуколектинами. Наиболее изучены фуколектины растений - утесника Ulex europaeus и аспарагуса Tetragonolobus purpureus, а также гриба, Aleuria aurantia и плазмы угря Anguilla anguilla [2]. Поиск и изучение новых фуколектинов представляет особый интерес в связи с участием фукоантигенов во многих патологических процессах [3]. Ранее нами были проведена предварительная качественная оценка специфичности фуколектина икры окуня, Perca fluviatilis (PFL) [4]. PFL состоит из двух типов субъединиц, каждая из которых содержит по 5 остатков триптофана [5], что позволяет использовать его триптофановую флуоресценцию для изучения углевод-белкового взаимодействия [6]. Цель работы - изучение количественных аспектов взаимодействия PFL c серией льюисовых олигосахаридов методом собственной белковой флуоресценции и определение констант ассоциации, Ka.
МЕТОДИКА
Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре "8Ытаё7и" 5000 (Япония), оборудованном термостатируемым кюветодержа-телем, в стандартной кварцевой кювете (1 х 1 см). Все измерения проведены при 25°С. Флуоресценцию образцов возбуждали светом ксеноновой лампы при длине волны 295 нм и ширине щели 5 нм на
обоих монохроматорах. Спектры поглощения измеряли на спектрофотометре Весктап БИ-8 (США). Олигосахариды (таблица) выделяли, как описано в работе [4].
Взаимодействие PFL с олигосахаридами. Алик-воты раствора олигосахарида (200-500 мМ) последовательно добавляли к раствору РРЬ (0.02 мг/мл) в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.2. Запись спектров проводили через 30 с после добавления олигосахарида и рассчитывали интегральную интенсивность флуоресценции (Р), проводя коррекцию на флуоресцентный фон олигосахарида, а также разбавление образца.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Взаимодействие РБЬ с олигосахаридами изучали по изменению флуоресценции белка после добавления к нему раствора углевода. При взаимодействии лектина с углеводом наблюдалось возрастание интенсивности флуоресценции белка (рисунок), что использовали для расчета константы связывания, Ка [7, 8]. При этом предполагалось, что изменение флуоресценции прямо пропорционально доле существующих центров, занимаемых лигандом, все центры имели одинаковую аффинность к лиганду, и связывание в одном центре не влияло на связывание в других центрах. Тогда а - доля существующих центров равна:
а = (Р - Рс)/(Рмакс - Р),
где Р - наблюдаемая флуоресценция, Р0 - флуоресценция в начальной точке титрования, Рмакс -флуоресценция полностью насыщенного лиган-
486 ПИСКАРЕВ и др.
Антигенные олигосахариды
Строение* Название Сокращение Антиген
0а1р1-401е Лактоза Lac Тип 6
0а1р1-401е 2
2'-Фукозиллактоза 2'-FL Н тип 6
Fucа1
0а1р1-301еМАер1-3Са1р1-4С1с Лакто-М-тетраоза LNT Ьес
0а1р1-301еМАер1-3Са1р1-4С1с 2
Лакто-М-фукопентаоза I LNFP I Ьеё (Н тип 1)
Fuca1
0а1р1-301еМАер1-3Са1р1-4С1с 4
Лакто-М-фукопентаоза II LNFP II Ьеа
Fuca1
0а1р1-401еМАер1-3Са1р1-4С1с 3
Лакто-М-фукопентаоза III LNFP III Ьех
Fuеa1
0а1р1-301е^Аер1-3Са1р1-4С1с 24
Лакто-М-дифукогесаоза I LND I Ьеь
Fuca1 Fuеа1
* Антиген выделен жирным шрифтом.
дами белка, найденная экстраполяцией графической зависимости Г от [5] в область бесконечной концентрации лиганда. Концентрация свободного олигосахарида может быть определена как
F, отн. ед. 2.42.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
läöA^T * ■ V
+А
_I_
• •б
□ 5
" л 'l, 2, 3, 4
_I_I_
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
[S], мМ
Изменение флуоресценции PFL при добавлении олигосахарида: 1-4 - Lac, LNT, LNFP II, LNFP III; 5 - LND I; б - 2'-FL; 7 - LNFP I.
С = [5] - [а][Р],
где [5] - концентрация добавленного олигосахарида, а [Р] - общая концентрация лектина. Из графика Скетчерда (а/С от а) определяли Ка.
Из рисунка видно, что РБЬ связывается с Ьес-пентасахаридом (LNFP I) и Н тип 6-трисаха-ридом, существенно слабее - с Ьеь-гексасахари-дом, а Ьеа-, Ьех- и Ьеё-содержащие олигосахариды (таблица) с РБЬ не взаимодействуют.
Рассчитанные таким образом значения Ка для взаимодействия РБЬ с данными олигосахаридами составили
Ь№Р I Ка = 6.6 х 103 М-1,
2'-БЬ Ка = 2.5 х 103 М-1,
ЬЖ I Ка = 4.0 х 102 М-1.
Ранее [6] была определена Ка = 3.4 х 102 М-1 для Ь-Бис. Таким образом, степень взаимодействия РБЬ с данными антигенами можно можно описать как:
Н тип 1 > Н тип 6 > Ьеь = Ь-Бис
Н тип 6 антиген является глюкоаналогом Н тип 2, то-есть происходит замена ацетамидной группы
ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ том 40 № 4 2004
7
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФУКОЛЕКТИНА ОКУНЯ
487
на гидроксил при С-2 в Б-в1с. Это либо не изменяет, либо незначительно уменьшает взаимодействие с фуколектинами [2]. Поэтому можно предположить, что в случае Н тип 2 ряд должен вы-глядить так:
Н тип 1 > Н тип 2 > Ьеь = Ь-Бис
В настоящее время изучается положение в этих рядах других фукоантигенов - А тип 2, АЬеь, а также Ьеу.
Таким образом, РБЬ относится к новому типу фуколектинов, узнающих Н-дисахарид Риса1-2ва1 в составе различных антигенов, в том числе в Н тип 1 и Ьеь, наряду с более традиционным взаимодействием с Н тип 2(6).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Feizi T, Childs R. // Trends Biochem. Sci.1985. V. 10. № 1 P. 24-29.
2. Goldstein I.J., Poretz R.D. // The Lectins / Eds. I.E. Liener, N. Sharon, I.J. Goldstein. N. Y.: Acad. Press, 1986. P. 196-209.
3. Listinsky J, Siegal G, Listinsky C. // Am. J. Clin. Pathol. 1998. V. 110. № 2. P. 425-440.
4. Пискарев BE, Прайзелъ О.Ю, Евстигнеева Р.П, Ямское И.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 1. С. 105-109.
5. Bazil V., Entlicher G. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. V. 31. № 3. P. 431-442.
6. Krajhanzl A.,Horejsi V., Kocourek J. // Biochim. Bio-phys. Acta. 1978. V. 532. № 2. P. 215-224.
7. Lee. C. // J. Biochem. 1997. V. 121. № 5. P. 818-825.
8. Jolley ME, Glaudemans C P J. // Carbohydr. Res. 1974. V. 33. № 2. P. 377-382.
Interaction of Perch Fucolectin with Lewis Antigens
V. E. Piskarev*, T. L. Bushueva**, and I. A. Yamskov*
* Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia;
e-mail: piskarev@ineos.ac.ru ** Institute of Experimental Cardiology, Russian Cardiology Research Center, Moscow, 121552 Russia
Abstract—Interaction of fucolectin of perch Perca fluviatilis (PFL) with a set of Lewis antigens was studied by monitoring changes in its tryptophan fluorescence. PFL bound Lec (H type 1)-pentasaccharide (Ka = 6.6 x x 103 M-1) and H type 6-trisaccharide (Ka = 2.5 x 103 M-1); essentially weaker, with Leb-hexasaccharide (Ka = = 4.0 x 102 M-1); and failed to interact with Lea-, Lex-, and Led-containing oligosaccharides. PFL belongs to a new type of the fucolectins recognizing H-disaccharide Fuca1-2Gal within various antigens, including H type 1/2 and Leb.
ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ том 40 < 4 2004
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.