ФИЗИКОХИМИЯ ПОВЕРХНОСТИ И ЗАЩИТА МАТЕРИАЛОВ, 2013, том 49, № 4, с. 397-402
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ НА МЕЖФАЗНЫХ ГРАНИЦАХ
УДК 543.183
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АЛЬБУМИНА С ПОВЕРХНОСТЯМИ КРЕМНЕЗЕМНОГО И УГЛЕРОДНОГО АДСОРБЕНТОВ
© 2013 г. Н. А. Эльтекова, Н. П. Соколова, А. М. Горбунов, А. Ю. Эльтеков
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физической химиии электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук, 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 31, корп. 4 E-mail: ninel-elt@yandex.ru Поступила в редакцию 12.04.2012 г.
Методами адсорбции из растворов и ИК-спектроскопии изучено поведение макромолекул бычьего сывороточного альбумина на поверхности макропористого кремнеземного и мезопористого углеродного адсорбентов при 293 К. Анализ изотерм адсорбции и ИК-спектров альбумина, адсорбированного кремнеземным и углеродным адсорбентами, позволяет оценить влияние химической природы поверхности и структуры адсорбента на положение и форму изотерм адсорбции и на характер межмолекулярных взаимодействий в системе белок—адсорбент. Обсуждены особенности поведения макромолекул альбумина при взаимодействии с кремнеземным и углеродным адсорбентами.
Б01: 10.7868/80044185613040037
ВВЕДЕНИЕ
Исследование взаимодействий макромолекул белков с поверхностями высокодисперсных твердых тел актуально не только для лучшего понимания фундаментальных аспектов адсорбции биополимеров, но и необходимо в разработке технологических процессов в биохимии и медицине. В настоящее время большое внимание уделяется фундаментальным исследованиям взаимодействия макромолекул белков и ферментов с поверхностями твердых тел в связи с использованием высокодисперсных кремнеземных и углеродных адсорбентов в качестве носителей для иммобилизации белковых и лекарственных препаратов [1, 2]. В отечественной и зарубежной литературе имеется ряд работ, посвященных адсорбционному и ИК-спектроскопическому исследованию взаимодействия макромолекул глобулярных белков с кремнеземными адсорбентами-носителями [3—5], однако, в отношении углеродных адсорбентов-носителей такие работы практически отсутствуют.
Цель настоящей работы заключалась в изучении адсорбционными и спектральными методами взаимодействия глобулярного белка — бычьего сывороточного альбумина с поверхностями кремнеземного и углеродного адсорбентов для оценки влияния химической природы поверхности и структуры адсорбента на межмолекулярные взаимодействия в системе белок—адсорбент.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объекта исследования был взят альбумин сыворотки быка (БСА) (Серва, Германия) со следующими характеристиками: молекулярная масса — М = 67000 Эа, размер макромолекулы белка — Н = 11.6 х 2.7 х 2.7 нм, изоэлектрическая точка 4.7—5.0. Перед адсорбционными опытами белок не подвергался дополнительной обработке. Растворителем служила бидистиллированная вода. В качестве адсорбентов-носителей были использованы два адсорбента: широкопористый кремнезем — Силохром С-80 (завод Люминофор, Ставрополь) с удельной поверхностью S, равной 100 м2 г-1, преимущественным диаметром пор dр, равным 55 нм и объемом пор Ур, равным 1.3 см3 г-1 и мезопористый углеродный адсорбент - Сибунит, с удельной поверхностью S, равной 130 м2 г-1, преимущественным диаметром пор dр, равным 15 нм и объемом пор Ур, равным 0.75 см3 г-1. Си-бунит был получен в ИПП СО РАН (Омск) путем высокотемпературного крекинга углеводородов на поверхности частиц нанодисперсного технического углерода с последующей активацией и графитированием при 2700 К в токе аргона [6].
Методика проведения эксперимента по адсорбции из растворов подробно описана ранее [7, 8]. Адсорбционные опыты проводили в стеклянных ампулах емкостью 10 мл, в которые помещали 0.1-0.5 г предварительно высушенного в вакуумном сушильном шкафу при 373 К в течение 2 ч адсорбента, и приливали 2-5 мл водного раствора
(а)
200
150
Т
2 100
1-Т
50 -
20
15
т
1-С
§ 10
1-Т
5
0 ь.
0 2 4 6 8 10 С, мг мл -1
0 2 4 6 8 10 С, мг мл -1
Рис. 1. Изотермы избыточной адсорбции БСА из водных растворов кремнеземным адсорбентом Силохром С-80 (а) и углеродным адсорбентом Сибунит (б), температура 293 К.
белка определенной концентрации. Ампулы выдерживались в термостате при постоянной температуре 293 К до установления адсорбционного равновесия. Анализ исходной и равновесной концентрации водных растворов белка проводили с помощью лабораторного жидкостного интерферометра ИТР-1.
Величину избыточной (по Гиббсу) адсорбции белка Г вычисляли по формуле
Г = (С0 - С)У/ш,
(1)
где С0 и С — исходная и равновесная концентрации водных растворов белка, V — объем водного раствора белка, т — масса адсорбента.
ИК-спектры изученных адсорбционных систем записывались на Фурье-ИК-спектрометре Перкин-Элмер 2000 (Перкин Элмер, США). Для исследования твердых образцов применялся метод диффузного отражения с использованием приставки фирмы Перкин-Элмер, модифицированной в ИФХЭ РАН для специальных целей, в некоторых случаях проводилось прессование с бромистым калием. Спектры растворов и осадков из растворов исследовались на пластинках из КРС-5 методом пропускания. Для увеличения отношения сигнал/шум проводилось накопление и усреднение спектров по 1000 сканированиям.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ряде работ [2, 5, 9—17] было показано, что одной из особенностей адсорбции макромолекул белков из разбавленных водных растворов на поверхности твердых тел является проявление электростатических сил, оказывающих существенное влияние на адсорбционное взаимодействие заря-
женных макромолекул белков с поверхностью адсорбента.
На рис. 1 приведены изотермы избыточной адсорбции макромолекул БСА из водных растворов широкопористым кремнеземным адсорбентом Си-лохром С-80 и углеродным адсорбентом Сибунит.
Положение и форма изотермы адсорбции БСА определяются главным образом структурой и химической природой поверхности адсорбентов. Из рис. 1а видно, что изотерма адсорбции БСА из водных растворов на Силохроме С-80 имеет резкий подъем и уже в области равновесной концентрации 4 мг мл-1 достигает максимальных величин адсорбции, порядка 200 мг г-1, что свидетельствует о формировании адсорбционного слоя макромолекул БСА на поверхности кремнеземного адсорбента. В отличие от Сило-хрома С-80, изотерма адсорбции БСА на углеродном адсорбенте Сибунит (рис. 1б) характеризуется более пологим подъемом и значительно меньшими величинами адсорбции. Кроме того, в области изученных равновесных концентраций не происходит формирования адсорбционного слоя белка на углеродном адсорбенте, о чем можно судить по форме изотермы адсорбции.
В процессе сорбции пористыми материалами макромолекулы белка концентрируются вблизи входных отверстий в поры адсорбента. Скорость диффузии белковых макромолекул в объемном растворе мала, а внутренняя диффузия в поры, размер которых соизмерим с размерами сольва-тированных макромолекул, замедляется вследствие стерических препятствий. Так время достижения адсорбционного равновесия для макромолекул белка БСА на широкопористом кремнеземе — Сило-хроме С-80 с преимущественным диаметром пор 55 нм составляет 4 часа, а на мезопористом углеродном адсорбенте Сибуните, который характеризуется широким распределением объема пор по размерам с максимумом кривой распределения при эквивалентном диаметре 15 нм, составляет более 24 часов. Ранее в работе [8] было показано, что в разбавленных водных растворах (С = 2—8 мг мл-1) при 293 К для макромолекул БСА характерна самоорганизованная структура с размером 25 нм. Это указывает на присутствие в водных растворах сильно ассоциированных и сольватированных самоорганизованных структур макромолекул БСА. Таким образом, значительное замедление процесса адсорбции и более низкие значения максимальных величин адсорбции БСА углеродным адсорбентом Сибунит, по сравнению с Силохромом С-80, связано с недоступностью части порового пространства Сибунита для самоорганизованных в водном растворе структур макромолекул БСА.
При приближении макромолекул БСА к пористым частицам кремнеземного адсорбента скорость диффузии замедляется. Электростатический заряд
0
гидрофильной поверхности кремнезема (точка нулевого заряда рН = 2-3 [14]) вызывает отталкивание макромолекулы БСА (изоэлектрическая точка рН = = 4.7 [16]). Однако, под действием сил гидрофобного взаимодействия происходит перегруппировка в структуре макромолекулы белка. За счет гидрофильных участков макромолекулы БСА прочно сорбируются на поверхности устьев пор, что приводит к существенному сужению пор на толщину адсорбционного слоя прочно связанных макромолекул альбумина. Таким образом, отрицательно заряженные макромолекулы альбумина самопроизвольно (при рН = 7.0) адсорбируются на отрицательно заряженной поверхности гидрофильного кремнезема. Движущей силой адсорбционного взаимодействия следует считать силу, возникающую от компенсации электростатического отталкивания одноименно заряженных частиц и поверхности, и притяжением, возникающим под действием соответствующих гидрофобных (дисперсионных) сил.
Поскольку белки относятся к классу полиэлектролитов, то они несут как положительные, так и отрицательные заряды. Считают, что положительные заряды локализуются на группах МИ+ пептидной цепи белка, а отрицательные заряды -на группах СОО-. Поэтому при адсорбции белков на гидрофильных поверхностях в основном проявляется электростатическое взаимодействие. Электрические заряды на поверхности макромолекулы белка нейтрализуются противоионами окружающего водного раствора и поэтому образуется двойной электрический слой. При сближении макромолекул белка с поверхностью происходит перекрывание этих двойных электрических слоев. При этом происходит обратимое перераспределение электрических зарядов, ионы из объемного раствора внедряются в адсорбционный слой белка [11, 12].
При адсорбции происходит изменение в гидратации как макромолекулы белка, так и поверхности адсорбента. При этом гидрофильные участки макромолекулы и поверхности сорбента сохраняются в прежнем состоянии, дегидратация протекает с гидрофобных участков, что благоприятствует гидрофобному взаимодействию бел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.