БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 8, с. 1009 - 1014
УДК 577.152.1
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГИДРОГЕНАЗЫ HYDSL ПУРПУРНОЙ СЕРНОЙ БАКТЕРИИ Thiocapsa roseopersicina BBS С МЕТИЛВИОЛОГЕНОМ И ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫМИ ПОЛИПЕПТИДАМИ*
© 2014 А.В. Абдуллатыпов**, Н.А. Зорин, А.А. Цыганков
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2; электронная почта: azatik888@yandex.ru
Поступила в редакцию 02.04.14 После доработки 18.04.14
Исследовано действие ряда полипептидов с различным зарядом на активность гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina. Показан сильный ингибирующий эффект полилизина (К20), имеющего положительный заряд. Ингибирующее действие полилизина было обратимым и конкурентным по отношению к акцептору электронов — окисленному метилвиологену в реакции окисления водорода, катализируемой гидрогеназой. Полипептиды с меньшим положительным зарядом производили меньший ингибиторный эффект, а незаряженные полипептиды и полипептиды с отрицательным зарядом не проявляли ингибирующего эффекта на гидрогеназу. Моделирование взаимодействия (докинг) полилизина с гидрогеназой T. roseopersicina указывает на высокое сродство акцептор-связывающего центра фермента к этому полипептиду. Рассчитанная величина константы связывания полилизина с гидрогеназой близка к экспериментально определенной (K = 2,1 мкМ).
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гидрогеназа, метилвиологен, полипептиды, конкурентное ингибирование, молекулярный докинг.
Гидрогеназа, ключевой фермент в метаболизме водорода у микроорганизмов, катализирует обратимую реакцию восстановления протонов до молекулярного водорода:
2Н+ + 2e- ^ Н2.
К настоящему времени известно более 400 генов, кодирующих гидрогеназы [1, 2], выделено и охарактеризовано более трех десятков этих ферментов, а для примерно десяти гидрогеназ уже известна трехмерная структура [3]. Проводятся обширные исследования активного центра гидрогеназ разных типов [4]. Однако молекулярные механизмы взаимодействия гидрогеназы с донором/акцептором электронов в литературе практически не рассмотрены.
Термостабильная гидрогеназа HydSL, выделенная из пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina BBS, относится к Ni-Fe-гидрогена-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-084, 13.07.2014.
** Адресат для корреспонденции.
зам и обладает высокой каталитической активностью и устойчивостью к действию ряда денатурирующих факторов [1]. Высокое сродство гидрогеназы Т. гояеоретста к положительно заряженным ионам металлов, метилвиологену, а также к положительно заряженному полимеру нейтрального красного [5] позволяют предположить, что электростатические взаимодействия играют важную роль в функционировании донор/акцептор-связывающего центра этого фермента. До настоящего времени полная пространственная структура гидрогеназы Т. гозеоретста не установлена. Однако высокая степень гомологии первичной последовательности этого фермента с гидрогеназами с известной структурой позволила нам создать ее пространственную модель [6]. В практическом плане гидрогеназы представляют интерес для разработки водородных ферментных электродов. Показано, что положительно заряженные полипептиды, в частности, полилизин, стабилизируют мономолекулярные пленки гидрогеназы Т. го-яеорешста, но механизм взаимодействия таких полипептидов с ферментом не изучен [7].
Помимо экспериментально установленной стабилизирующей роли полилизина можно
предположить его возможную роль как заякори-вающего агента для иммобилизации гидрогена-зы на электроде. Для его применения в этом качестве необходимо проверить, как именно молекула полилизина может взаимодействовать с гидрогеназой.
Целью данной работы являлось экспериментальное изучение влияния заряженных полипептидов на реакцию восстановления метилви-ологена водородом, катализируемую гидрогена-зой, моделирование пространственного взаимодействия гидрогеназы с метилвиологеном и полипептидами на основе докинга и сравнение полученных экспериментальных результатов с расчетными данными.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клетки пурпурной серной бактерии T. roseoper-sicina BBS выращивали в анаэробных фотогетеротрофных условиях на модифицированной среде Пфеннига [8] в присутствии 0,2%-ного ацетата натрия.
Получение экстрактов клеток и очистка гидро-геназы. Клетки отделяли от культуральной жидкости в конце экспоненциальной фазы роста; 200 г клеточной пасты ресуспендировали в 20 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0, в соотношении 1 : 1, и клетки разрушали с помощью ацетона и ультразвука как описано ранее [9]. Очистку гидрогеназы выполняли с использованием фракционирования экстрактов клеток сульфатом аммония и жидкостной хроматографии на колонках с фенилсефарозой CL-4B и ДЭАЭ-целлюлозой DE52 [10]. Окончательную стадию очистки препарата гидрогеназы осуществляли препаративным электрофорезом в 7%-ном ПААГ как описано ранее [11].
Определение гидрогеназной активности проводили на основе реакции восстановления окисленного метилвиологена водородом в кювете Тунберга с помощью спектрофотометри-ческого метода [9]. Реакционная смесь (общий объем 2 мл) содержала 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 9,0, 4 мМ раствор метилвиологена и 1—10 мкг гидрогеназы. Для инициирования реакции добавляли следовые количества (5—10 мкл) 20 мМ раствора дитионита натрия, приготовленного в анаэробных условиях [9]. Все измерения активности фермента проводили при температуре 30°. Для расчета активности использовали молярный коэффициент поглощения восстановленного метилвиологена (е600 = 13 , 00 мМ-1 • см-1) [12]. Ферментативную активность выражали в мкмоль Н2/мин на 1 мг белка.
Моделирование взаимодействия гидрогеназы с метилвиологеном и полипептидами. Для определения сайтов взаимодействия полипептидов и метилвиологена с гидрогеназой был проведен молекулярный докинг. В качестве рецептора была взята полноразмерная модель гидрогеназы HydSL T. roseopersicina, построенная и описанная ранее [6].
Докинг молекул проводили с помощью программы Autodock Vina [13].
При докинге были приняты следующие допущения: 1) метилвиологен является жесткой плоской молекулой и обладает суммарным зарядом +2, распределенным равномерно по атомам двух пиридиновых колец (см. цветную вклейку, рис. 1); 2) молекулы полипептидов К20 и K(KLK)6K являются жесткими и имеют форму a-спиралей (жесткость структуры была принята вследствие низкой точности расчетов при до-кинге больших гибких лигандов); 3) молекула гидрогеназы является жесткой; 4) взаимодействие метилвиологена с большой субъединицей гидрогеназы HydSL не приводит к переносу электрона, поэтому взаимодействие полипептидов с большой субъединицей не является инги-бирующим; 5) размер ячейки для докинга превышает размер гидрогеназы (необходимо для охвата обеих молекул — фермента и лиганда) и равен 90 х 90 х 90 Á.
Лиганды (метилвиологен и полипептиды K20, K(KLK)6K) были построены в программах Yasara Model [14] и Autodock Tools [15]. Заряды для молекулы метилвиологена корректировали вручную в текстовом редакторе Akelpad по следующей схеме: заряд атомов углерода метиль-ных групп равен нулю, заряд всех остальных атомов равен +0,167 (такое допущение объясняется тем, что метилвиологен имеет заряд +2, распределенный равномерно по 12 атомам ароматических пиридиновых колец).
Расчетные константы связывания молекул с гидрогеназой вычисляли по следующей формуле:
K = eAG/RT,
где AG — энергия Гиббса образования комплекса фермента и лиганда в Дж/моль, R = 8,314 Дж • • моль-1 • К-1 — универсальная газовая постоянная, Т — температура (303 К) [16].
В работе использовали полипептиды K20, K(KLK)6K, L20, E20 и реактивы для ПААГ электрофореза «Sigma» (Германия), фенилсефарозу CL-4B «Pharmacia» (Швеция), ДЭАЭ-целлюло-зу DE52 «Whatman» (Англия), метилвиологен и дитионит натрия «Fluka» (Швейцария). Остальные реактивы — отечественного производства марок х.ч. и ос.ч.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние полипептидов на активность гидрогеназы. Акцепторы электронов в реакции окисления молекулярного водорода, катализируемой гидрогеназой, имеют положительный заряд. Роль акцептора электронов в этой реакции, наряду с природными акцепторами электрона, могут выполнять различные виологены, имеющие заряд 2+ в окисленном состоянии, а также катионы никеля и кадмия, которые гидрогеназа восстанавливает в атмосфере водорода до металлического состояния [17]. Таким образом, электростатическое взаимодействие имеет важное значение для взаимодействия фермента с субстратом (акцептором). Как было показано ранее [9], катионы ряда металлов проявляют высокое сродство к гидрогеназе T. roseopersicina и являются обратимыми и конкурентными по отношению к метилвиологену ингибиторами фермента. Увеличение сродства гидрогеназы к катионам при повышении рН [9], когда увеличивается отрицательный заряд молекулы фермента, свидетельствует о важном вкладе электростатических взаимодействий в ингибирование гидро-геназы T. roseopersicina катионами этих металлов. Нами было сделано предположение, что и другие вещества с положительным зарядом могут иметь высокое сродство к гидрогеназе и быть конкурентными ингибиторами по отношению к акцептору электронов. Для проверки этого предположения в качестве модельных полиионов были использованы полипептиды с различным зарядом. Наиболее сильный ингибирую-щий эффект проявлял полилизин (К20), имеющий значительный положительный заряд (рис. 2). Ингибирующее действие полилизина было обратимым и конкурентным по отношению к акцептору электронов — окисленному метилвио-логену в реакции окисления водорода, катализируемой гидрогеназой. Константа ингибирова-ния, отражающая сродство этого пептида к гидрогеназе, составляла Ki = 2,1 мкМ. Эта константа на два порядка ниже величины Кт = 182 мкМ для метилвиологена [18]. Полипептиды с меньшим положительным зарядом имели меньший ингибиторный эффект. Так, полилизин-лейцин (K(KLK)6K), имеющий в своем составе 14 остатков лизина и 6 остатков лейцина, которые не имеют заряда, проявлял значительно меньший ингибирующий эффект, конкурентный по отношению к окисленному метилвиологену, с Ki
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.