БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 4, с. 530 - 541
УДК 577.112.8
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ХИТОЗАНОВ И ^АЦИЛИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХИТОЗАНОВ С ЛИПОПОЛИСАХАРИДАМИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ*
© 2008 г. Г.А. Набережных**, В.И. Горбач, Г.Н. Лихацкая, В.Н. Давыдова, Т.Ф. Соловьева
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН,
690022 Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159; факс: (4232)314-050электронная почта: naber1953@mail.ru
Поступила в редакцию 06.09.07
Изучено взаимодействие липополисахарида (ЛПС) с природным поликатионом хитозаном и его производными: высокомолекулярным хитозаном (80 кДа), с различной степенью ацетилирования, низкомолекулярным хитозаном (15 кДа), ацилированным олигохитозаном (5,5 кДа) и ацилированными хитоолигосахарида-ми (биоза, триоза, тетраоза) с помощью лиганд-ферментного твердофазного анализа. Установлено, что ЛПС-связывающая активность хитозана с молекулярной массой 80 кДа уменьшается при увеличении степени ацетилирования. Аффинность взаимодействия ЛПС с хитозаном возрастает при введении в его молекулу длинноцепочечного жирнокислотного остатка. Активность М-моноацилированных хитоолигосахари-дов падает в ряду: олигохитозан ^ тетра ^ три ^ дисахаридные производные. Методом компьютерного моделирования получены пространственные модели комплексов Я-ЛПС с хитозаном с различной степенью ацетилирования, хитоолигосахаридами и их моноацилированными производными. Установлено, что увеличение количества ацетатных групп приводит к уменьшению связей, стабилизирующих комплекс, к снижению энергии связи липополисахарида с олигохитозаном и к изменению положения наиболее выгодного сайта связывания. Показано, что сайты связывания хитоолигосахаридов на Я-ЛПС перекрываются и энергия связывания возрастает с увеличением количества моносахаридных остатков в молекуле. Сделано заключение о том, что вклад ацильного фрагмента в энергию образования комплекса наиболее сильно проявляется при расчетах энергии комплексов в водной фазе и обусловлен гидрофобным взаимодействием ациль-ного фрагмента хитоолигосахаридов с жирнокислотными остатками молекулы ЛПС.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: липополисахарид, хитозан, связывание, компьютерное моделирование.
Липополисахарид (ЛПС, эндотоксин), один из основных компонентов внешней мембраны грамотрицательных бактерий, играет ключевую роль в возникновении комплексного клинического синдрома — септического шока. ЛПС — ам-фифильный биополимер, который состоит из трех структурно различающихся частей: О-спе-цифического полисахарида, олигосахарида кора и липида А (рис. 1) [1, 2]. Токсическим центром ЛПС является его гликолипидный фрагмент — липид А, структура которого подобна для многих грамотрицательных бактерий [3]. Липид А состоит из дифосфорилированного дисахарида
Принятые сокращения: ЛПС — липополисахарид, Х-ВМ — хитозан высокой молекулярной массы, Х-НМ — хитозан низкой молекулярной массы, Х-ОС -хитоолиго-сахарид, Х-ОЛ — олигохитозан, Б-Х-НМ — биотинилиро-ванный хитозан, ЛФТА — лиганд-ферментный твердофазный анализ, СА — степень N-ацетилирования.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, ВМ 07-298, 27.01.08.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
глюкозамина, который ацилирован различным количеством жирных кислот. Во внутренней области олигосахарида кора также присутствуют в достаточно большом количестве анионные группы: фосфатные, пирофосфатные и карбоксильные. Отрицательный заряд и амфифильная природа молекул ЛПС делает его способным связываться с лигандами, молекулы которых положительно заряжены и амфифильны, и ли-пид А рассматривается как потенциальная мишень для соединений, нейтрализующих эндо-токсическую активность ЛПС [4].
В настоящее время из различных природных источников выделен целый ряд катионных белков, пептидов, полиаминов, способных связываться с ЛПС и изменять его эндотоксические свойства [4—6]. Амфифильный поликатионный пептид — полимиксин В, один из наиболее эффективных нейтрализаторов ЛПС, обладает значительной токсичностью [4]. Несколькими группами исследователей ведется поиск синтетических нетоксичных липополиаминов, которые способны с высокой аффиностью связывать
ЛПС и могут быть использованы в терапии септического шока [6, 7]. Наиболее эффективное связывание показали моно- и диацилированные полиамины, содержащие 14—16 атомов углерода в ацильном остатке [8, 9]. Методом компьютерного моделирования установлено, что существенное влияние на аффиность связывания ли-пополиаминов с липидом А оказывает количество заряженных групп в поликатионах и расстояние между ними [10].
Ранее нами показано, что катионный полиэлектролит хитозан, линейный полисахарид, состоящий из р-1,4-связанных остатков глюкоза-мина, взаимодействует с ЛПС с образованием стабильных комплексов различной стехиометрии [11]. Исходя из литературных данных о взаимодействии липополиаминов с ЛПС [6, 9], можно было предположить, что перспективными для высокоаффинного связывания ЛПС могут быть водорастворимые гидрофобные производные хитозана. В данной работе исследованы подходы, позволяющие повысить эффективность взаимодействия хитозана с ЛПС. С этой целью были получены хитозаны с различной степенью М-ацетилирования; хитоолигосахари-ды, М-ацилированные длинноцепочечной жирной кислотой, и изучена ЛПС-связывающие активности этих соединений.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы ЛПС из Esherichia coli 055:B5, N-гидроксисукцинимид-ный эфир биотинамидогексановой кислоты, конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена («Sigma», США), мембраны для ультрафильтрации («Millipore», США). Все остальные реактивы имели классификацию «х.ч.» («Реахим», Россия) и использовались без дополнительной очистки.
1Н-ЯМР-спектры образцов получены на приборе DPX-300 («Bruker Physik», США) при 300 МГц. В качестве растворителя использовали D2О, в качестве внутреннего стандарта — ацетон (химический сдвиг 8Н = 2,225 М.Д и 8С = 23,52 М.Д.).
Для буферных систем использовали растворы, содержавшие 0,01 М СН3СОО№/СН3СООН, рН 5,5 (буфер А), 0,01 М Tris-На, pH 7,2, содержавший 0,5% желатина и 0,25% Tween 20 (буфер Б).
Получение хитозана высокой молекулярной массы (Х-ВМ). Коммерческий хитозан (40 г), полученный щелочной обработкой хитина из крабов, со степенью N-ацетилирования (СА) 17%, дезацетилировали смесью водная щелочь (40% №ОН)—изопропиловый спирт (1 : 16, V/V) нагреванием смеси в течение 7 ч при 100°. Оса-
док фильтровали, растворяли в воде, рН которой доводили соляной кислотой до 3,5, диализо-вали против воды и лиофилизовали. В результате был получен хитозан (30,5 г) с молекулярной массой 80 кДа, определенной методом вискозиметрии [12], и СА = 1,7%, установленной методом !Н-ЯМР спектроскопии [13].
Получение хитозанов низкой молекулярной массы (Х-НМ). Коммерческий хитозан с СА 4% деполимеризовали перекисью водорода и описанным ранее способом [12] выделяли хитозан с
Рис. 1. Структура липополисахарида из E. coli K12. На рисунке отмечены липид А (I), олигосахарид кора (II) и О-специфический полисахарид (III). Обозначения структурных элементов приведены в соответствии с кристаллической структурой липополисахарида (код PDB 2FCP) [18]
молекулярной массой 15 кДа. Деполимеризацией Х-ВМ (8 г) перекисью водорода (1,7%) в течение 48 ч при 37°, осаждением изопропиловым спиртом и ультрафильтрацией на мембране с пределом эксклюзии 3 кДа получили 6,2 г олигохито-зана (Х-ОЛ) со средней молекулярной массой 5,5 кДа. Молекулярную массу Х-ОЛ устанавливали по количеству восстанавливающих концевых моносахаридов, используя метод, описанный в [14]. Ди-, три-, тетра-хитоолигосахариды были получены кислотным гидролизом Х-ВМ и последующей ионообменной хроматографией смеси олигосахаридов, как описано в работе [15].
Получение N-ацетилированных хитозанов. Навески Х-ВМ (0,5 г) растворяли в смеси 40 мл воды и 48 мл метанола и к полученным смесям добавляли разные количества уксусного ангидрида (0,028; 0,05; 0,12; 0,25; 0,5 мл). Смеси выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре, подщелачивали раствором аммиака до рН 9,0. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали метанолом, растворяли в разбавленной соляной кислоте (рН 3,5), диа-лизовали против воды и лиофилизовали. СА полученных хитозанов, определенная методом !Н-ЯМР-спектроскопии [13], составила 2,8; 3,7; 8,1; 9,3 и 14,6%.
Получение N-ацилированных хитозанов. Хи-тоолигосахариды (Х-ОС) ацилировали N-гид-роксисукцинимидным эфиром 3-гидрокситет-радекановой кислоты, как описано в работе [15]. Х-ОЛ (0,8 г) ацилировали N-гидроксисукцини-мидным эфиром 3-гидрокситетрадекановой кислоты (0,4 г) в смеси растворителей вода — ^№-диметилфорамид (200 мл, 1 : 2, V/V) в течение 48 ч при 37°. рН смеси доводили соляной кислотой до 3,0, не связавшуюся жирную кислоту экстрагировали 3 раза н-бутанолом, низкомолекулярные примеси удаляли ультрафильтрацией водного раствора и раствор лиофилизовали. Выход неочищенного продукта составил 0,65 г. Для очистки ацилированный Х-ОЛ (0,15 г) растворили в 1,5 мл подкисленной воды, раствор нанесли на колонку с 5 мл обратнофазного сорбента Octadecyl Si100-Polyol («Serva», Германия), хи-тозан, не связавшийся с сорбентом, элюировали водой, связавшийся — возрастающим градиентом ацетонитрила в воде (5—100%). Хитозан во фракциях определяли реакцией аминогрупп с тринитробензолсульфокислотой [16]. Фракция, элюированная 20-40%-ным ацетонитрилом, по данным ГЖХ и !Н-ЯМР спектроскопии, в среднем содержит один остаток жирной кислоты на молекулу Х-ОЛ. Выход ацилированного Х-ОЛ составил 0,062 г.
Введение биотина в хитозан. Х-НМ (6 мг) растворяли в 0,1 мл 0,1 М уксусной кислоты,
раствор разбавляли до 1 мл водой и доводили рН до 7,5, добавив 0,1 М NaOH. Затем добавляли 1 мг N-гидроксисукцинимидного эфира биотинами-догексановой кислоты, растворенного в 0,1 мл диметилсульфоксида, смесь перемешивали в течение 16 ч при 20°. Биотинилированный хитозан (Б-Х-НМ) выделяли гель-хроматографией на сефадексе G-50 в буфере А. Степень биотинили-рования меченого хитозана, которую определяли флуорометрическим методом, описанн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.