ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2009, том 64, № 7, с. 766-769
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.522
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ХРОМА С СИНЕ-ЗЕЛЕНОЙ МИКРОВОДОРОСЛЬЮ SPIRULINA PLATENSIS
© 2009 г. М. В. Фронтасьева*, С. С. Павлов*, Н. Г. Аксенова*, Л. М. Мосулишвили**, А. И. Белокобыльский**, Е. И. Киркесали**, Э. Н. Гинтури**, Н. Е. Кучава**
*Объединенный институт ядерных исследований 141980 Московская обл., Дубна, ул. Жолио-Кюри, 6 **Институт физики им. ЭЛ. Андроникашвили 380077 Грузия, Тбилиси, ул. Тамарашвили, 6 Поступила в редакцию 05.06.2008 г., после доработки 28.11.2008 г.
Особенности взаимодействия различных форм хрома с сине-зеленой микроводорослью Spirulina platen-sis исследованы с помощью инструментального нейтронного активационного анализа. Установлено, что в отличие от других микроорганизмов спирулина преимущественно усваивает нетоксичную, жизненно необходимую форму хрома(Ш) по сравнению с токсичной формой хрома(У1). С помощью фотометрии и электронного парамагнитного резонанса доказано отсутствие токсичных форм хрома с высокой степенью окисления в процессе аккумуляции хрома(Ш) клетками Spirulina platensis. Получена зависимость концентрации хрома(Ш) в хромсодержащей биомассе спирулины от концентраций хрома в питательной среде, позволяющая определять необходимые дозы хрома(Ш) в процессе культивации клеток. Контроль белкового состава и цитологического состояния клеток показал, что биомасса Spirulina platensis при культивации в выбранных условиях усваивает хром(Ш) в необходимых концентрациях и сохраняет свой белковый состав и природные полезные свойства, а значит, может быть использована для лечебно-профилактических целей.
Следы некоторых элементов - Бе, Си, Zn, Мо, 8е, Сг, N1, I и др., играют важную роль в метаболизме и жизненных функциях живых организмов [1-3]. Их избыток или недостаток может вызвать метаболические нарушения, которые в свою очередь приводят к специфическим заболеваниям, иногда с летальным исходом. Концентрации жизненно необходимых элементов поддерживаются в организме на определенном уровне посредством гомеостаза. Для лечения многих заболеваний, связанных с его нарушением в современной медицинской практике, применяют различные соединения, содержащие железо, цинк, хром, селен и другие элементы.
Установлено, что микроэлементы, участвующие в метаболизме дрожжей, водорослей и других микроорганизмов, хорошо усваиваются людьми и животными [4]. Поэтому в настоящее время особое внимание обращают на разработку новых препаратов на основе биологических матриц, обогащенных необходимыми элементами. Сине-зеленая микроводоросль ЗртИпа platensis (5. platensis), которая, как известно, способствует метаболизму и очищению организма человека от токсичных элементов, стимулирует иммунную систему, а также обладает антиканцерогенным и антивирусным эффектами, и поэтому может быть с успехом использована в качестве такой матрицы [5-7]. В процессе внутриклеточного метаболизма platensis, как и другие микроорганизмы, способна усваивать из питательной
среды в определенных количествах биогенные металлы [8]. При этом могут усваиваться также и токсичные металлы, поэтому необходимо исследовать возможность их присутствия в питательной среде при культивации клеток [9, 10].
Институтом физики им. Э.Л. Андроникашвили (Тбилиси, Грузия) совместно с Объединенным институтом ядерных исследований (ОИЯИ, Дубна, Россия) для применения в медицинской практике разработана оптимальная методика аккумуляции биомассой platensis таких необходимых элементов, как 8е, I, Сг и другие в соответствующих концентрациях без нарушения нормального состояния клеток и состава микроводоросли [11, 12].
Хром может существовать в нескольких валентных состояниях, из которых наиболее вероятны Сг(0), Сг(Ш) и Сг(У1). Хром(Ш) присутствует в естественном состоянии в окружающей среде и является необходимым элементом для живых организмов. Хроматы, содержащие хром(У1) и используемые обычно в промышленности, как известно, обладают значительным токсичным и канцерогенным эффектами.
В связи с тем, что поведение хрома в промежуточных состояниях хром(1У) и хром(У) и образование связанных с ними свободных радикалов в настоящее время недостаточно изучены, механизм токсичного и канцерогенного действия хрома(У1) не совсем выяснен. Установлено, что хром(У1) вы-
зывает различные нарушения ДНК, например, разрыв одиночных и поперечных связей.
В отличие от соединений хрома(УТ), соединения хром(Ш), являющиеся конечными продуктами восстановления хрома(УТ), относительно нетоксичны, неканцерогенны и немутагенны [13]. Поскольку хром(УТ) не взаимодействует с изолированной ДНК, важным этапом канцерогенеза после его попадания в организм человека считается восстановление хрома до низшей степени окисления [13]. Показано, что хром(У) действительно образуется in vivo при восстановлении хрома(УТ), причем он может способствовать генерации свободных радикалов. Возможно, что хром(У) и образующиеся при этом свободные радикалы участвуют в механизме токсикоза и канцерогенеза, вызванного хромом (VI) [14-16].
Проникновение катионов и анионов металлов внутрь клеток происходит обычно по селективным транспортным каналам, которые наиболее изучены для щелочных и щелочноземельных металлов,
а также анионов Cl-, HPOf, РОЗ-, SOf. Установлено, что хром (VI) транспортируется внутрь клеток через каналы, служащие для переноса эндогенных
анионов - SO2- и HPO4 [17]. Проникновение хром(Ш) в клетки значительно затруднено из-за его стереорасширения при гидратации, которое исключает возможность прохождения хрома(Ш) через клеточную мембрану. Различие в проникновении соединений хрома(Ш^Г) внутрь клеток детально обсуждается в обзоре [17]. Преимущественное проникновение хрома(УТ) по сравнению с хромом(Ш) характерно для клеток животных, растений, водорослей и бактерий [18-21]. Это подтверждают результаты исследований усвоения хрома(Ш) и хро-ма(УТ) иммобилизованными клетками цианобакте-рий Synechococus sp. PSS 7942 [22].
Тем не менее оказалось, что S. platensis, в отличие от других микроорганизмов, в процессе культивации клеток, наоборот, преимущественно усваивает из питательной среды хром(Ш), а не хром^Т). В настоящей работе представлены результаты исследования особенностей взаимодействия сине-зеленой микроводоросли S. platensis с различными формами хрома.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Использовали штамм EPPAS B-256 сине-зеленой микроводоросли Spirulina platensis из алгеологиче-ской коллекции Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Клетки S. platensis культивировали в стандартной водно-минеральной питательной среде Заруха при температуре 34°С, постоянном освещении флуоресцентной лампой (3000 люкс) и непрерывном перемешивании [23].
Для изучения особенностей взаимодействия S. platensis с хромом культивацию клеток прово-
дили как в кратковременном (в течение 60 мин), так и в длительном режиме - в течение 5 сут. Эксперименты в течение 60 мин проводили с использованием 2 г плотной суспензии S. platensis на 1 л питательной среды и дополнительной нагрузки 10 мг/л хро-ма(Ш) в виде Cr(CH3COO)3 и такой же концентрации хрома(У1) в виде дихромата калия. При проведении экспериментов по культивации клеток S. platensis в течение 5 сут в стандартную питательную среду хро-ма(Ш) добавляли в виде ацетата хрома, а хром(У1) -в виде дихромата калия в одинаковых концентрациях в интервале 0.25-15 мг/л. Ацетат хрома использовали в связи с тем, что неорганические соединения хрома в щелочной среде Заруха, в отличие от органических, образуют нерастворимый гидроксид хрома.
По окончании экспериментов биомассу отделяли от среды центрифугированием в течение 20 мин при 4°С, затем промывали и снова центрифугировали 20 мин при 15000 g. Полученный осадок высушивали в специальном адсорбционно-конденсационном лиофилизаторе оригинальной конструкции [24]. Таблетки для анализа готовили с помощью титановой прессформы.
Содержание хрома в биомассе S. platensis определяли методом нейтронного активационного анализа (НАА) на импульсном быстром реакторе ИБР-2 в Лаборатории нейтронной физики им. И.М. Франка Объединенного института ядерных исследований (Дубна, Россия) при потоке нейтронов 1012 н/см2 с. Параметры каналов облучения и пневмотранспорт-ной системы лаборатории активационного анализа детально описаны в работе [25], а методика экспериментов в работах [11, 12]. Качество аналитических измерений контролировали с помощью сертифицированных стандартов (IAEA Lichen-336, IAEA SDM-2T и Датский мох ДК-1).
Поскольку некоторые микроорганизмы, взаимодействуя с определенными элементами, способны менять их валентность, необходимо было проверить, не образуются ли токсичные формы хрома Cr(VI,V) в процессе аккумуляции хрома(Ш) клетками S. platensis. С этой целью в течение 7 дней проводили эксперименты по культивации спирулины в питательной среде при добавлении 10 мкг/л хрома(Ш). Каждый день отбирали пробы для фотометрического определения хрома(У1) и определения хрома(У) методом ЭПР.
Содержания хрома(У1) в диапазоне 0.1-10 мкг/мл определяли фотометрически с помощью 1,5-дифе-нилкарбазида при 540 нм [26, 27]. Содержание хро-ма(У) определяли методом ЭПР [чувствительность 5 х 10-10 г для хрома(У)].
Содержание белков в биомассе S. platensis определяли с помощью электрофореза в полиакрила-мидном геле (PAAG) по методу Леммли [28].
768 ФРОНТАСЬЕВА и др.
Аккумуляция хрома(Ш,У1) клетками platensis в течение 60 мин
Характеристика эксперимента Обработка биомассы Содержание хрома в сухой биомассе, мкг/г
Контроль: суспензия platensis (2 г/л), постоянное барботирование в течение 60 мин Промывание бидистиллятом 5.3
Суспензия platensis (2 г/л) + Сг(Ш) (10 мг/л), постоянное барботирование в течение 60 мин Промывание бидистиллятом Промывание бидистиллятом, 20 мМ ЭДТА и снова бидистиллятом 650 8.2
Суспензия platensis (2 г/л) + Сг(У!) (10 мг/л), постоянное барбатирование в течение 60 мин Промывание бидистиллятом Промывание бидистиллятом, 20 мМ ЭДТА и снова бидистиллятом ОО 00 5. 5.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице представлены результаты кратковременных экспериментов по ку
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.