Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2003, том 29, № 6, с. 577-588
УДК 577.(332 + 34):577.112.02
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КАРДИОТОКСИНА А5 С МЕМБРАНОЙ: РОЛЬ КОНФОРМАЦИОИНОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ И ГИДРОФОБНЫХ
СВОЙСТВ
© 2003 г. А. Г. Коншина*, П. Е. Волынский, А. С. Арсеньев, Р. Г. Ефремов
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437,ул. Миклухо-Маклая, 16110 Поступила в редакцию 25.07.2002 г. Принята к печати 05.09.2002 г.
С целью проверки гипотезы о существенной роли локальных конформационных различий кардио-токсинов (цитотоксинов, ЦТ) из яда змей при их взаимодействии с мембраной с помощью молекулярного моделирования исследовано поведение ЦТ А5 из яда кобры Naja atra в воде и на границе раздела мембрана-вода. Для ЦТ А5 известны две модели пространственной структуры, полученные методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и спектроскопии ЯМР в растворе. Как показал анализ данных молекулярной динамики (МД), петля II токсина в воде принимает определенную образную форму независимо от стартовой структуры. Изучение взаимодействия экспериментальных (РСА и ЯМР) и полученных в результате МД конформаций ЦТ А5 с липидным бислоем проводили методом Монте-Карло (МК) с использованием разработанной ранее модели неявно заданной мембраны. Установлено, что: 1) в отличие от ранее исследованного ЦТ2 из яда кобры Naja oxiana ЦТ А5 связывается с мембраной только петлями I и II и меньшим числом гидрофобных остатков; 2) Q-образная форма петли II и ее сближенность с петлей I обусловливают формирование на поверхности ЦТ А5 протяженной гидрофобной области, что способствует его встраиванию в липид-ный бислой; 3) при взаимодействии с мембраной конформация токсина сохраняется; 4) молекула ЦТ А5 имеет близкие значения потенциальной энергии в мембранном и водном окружениях, что позволяет предположить динамический характер связывания. Таким образом, результаты молекулярного моделирования свидетельствуют о том, что при взаимодействии цитотоксина с мембраной наиболее энергетически выгодными оказываются состояния с определенной конфигурацией петель I и II и, как следствие, со специфическим характером распределения полярных-неполярных свойств на поверхности токсина.
Ключевые слова: молекулярное моделирование, молекулярная динамика, метод Монте-Карло, модель сольватации белков, конформационный поиск.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что токсический эффект кардиотокси-нов (они же цитотоксины), выделяемых из змеиного яда, обусловлен их взаимодействием с клеточной мембраной. Однако локализация функционально активных участков и механизм связывания этих белков с липидным бислоем изучены мало. Представители семейства цитотоксинов - небольшие высокоосновные р-структурные белки, обладающие широким спектром биологического действия [1]. Они вызывают гиперсокращение мышечных волокон сердечной ткани, индуцируют лизис различных типов клеток (эритроцитов, эпителиальных и пр.) [2], а также, вероятно, способны инги-
Сокращения: ЦТ - цитотоксин(ы); МД - молекулярная динамика; МК - Монте-Карло; АПС - атомные параметры сольватации; МГП - молекулярный гидрофобный потенциал; СКО - среднеквадратичное отклонение.
# Автор для переписки (тел.: (095) 336-20-00; эл. почта: паБ-tya@nmr.ru).
бировать ряд мембраносвязанных ферментов (ки-наза С, Na/K-ATP-аза и др.) [3], участвовать в формировании ионных каналов в клеточной мембране [4]. In vitro они обусловливают слияние и лизис фосфолипидных везикул, дестабилизируя структуру бислоя и индуцируя межмембранное смешивание липидов [5].
Все известные пространственные структуры кардиотоксинов, полученные экспериментальными методами, имеют сходный тип упаковки полипептидной цепи в пространстве - трехпетлевую структуру, стабилизированную четырьмя дисуль-фидными связями. Однако, несмотря на сходство пространственных моделей и высокий уровень гомологии аминокислотных последовательностей (до 90%), параметры биологической активности цитотоксинов существенно различаются. Характер кардиотоксин-липидного взаимодействия во многом определяется наличием в аминокислотной последовательности второй петли одного из клю-
чевых консервативных остатков: пролина (ЦТ Р-типа) или серина (ЦТ S-типа). Кардиотоксины Р-ти-па сильнее взаимодействуют с мембранами, обладают более высокой гемолитической активностью [6]. Токсины обоих типов взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфолипидными бислоя-ми, но с цвиттерионными липидами связываются лишь ЦТ Р-типа [7]. Способность дестабилизировать бислой коррелирует с числом гидрофобных остатков, образующих протяженный неполярный участок молекулярной поверхности. Так, у ЦТ Р-типа петля П более гидрофобна, чем у ЦТ S-типа.
Установлено, что важная роль при взаимодействии цитотоксинов с мембраной принадлежит гидрофобным участкам, расположенным на окончаниях петель. Предполагается, что ЦТ S-типа связываются с мембраной только первой петлей, а ЦТ Р-типа - двумя или даже тремя петлями, что обеспечивает более глубокое проникновение в липидный бислой [6]. О пространственной структуре кардиотоксинов в мембраносвязанном состоянии известно мало. Лишь недавно определена пространственная структура ЦТ2 из яда кобры Naja oxiana (ЦТ Р-типа) в мицеллах додецилфос-фохолина [8], где мотивом связывания с бислоем являются три гидрофобных петлевых участка молекулы. В водном растворе ЦТ2 принимает две конформации - так называемые основную и минорную формы [9]. Соотношение между населен-ностями этих состояний составляет 6:1. Интересно, что с мембраной взаимодействует лишь основная форма ЦТ2 [8]. Различие между формами обусловлено конфигурацией пептидной связи Val7-Рго8 и, как следствие, пространственной структурой петли I.
Следует отметить, что высокая конформаци-онная подвижность первой и второй петель вообще характерна для представителей семейства цитотоксинов [1, 6] и, вероятно, является их общей функциональной и/или структурной особенностью. Структурно-функциональная гетерогенность молекул ЦТ указывает на то, что, несмотря на значительное сходство укладки полипептидной цепи в пространстве, существенную роль при их взаимодействии с мембраной играют локальные кон-формационные различия на участках связывания с бислоем. Источником информации о таких различиях могут служить, прежде всего, экспериментальные методы исследования пространственной структуры белков, связанных с мембраной. Однако они довольно трудоемки и в силу ряда технических сложностей (приготовление образцов и пр.) не всегда осуществимы. В связи с этим в настоящее время все более актуальным становится использование методов молекулярного моделирования.
Уже накоплено довольно много информации по взаимодействию с мембраной белков и пептидов,
в которых основным мотивом связывания с бислоем является а-спираль, преимущественно гидрофобная (в случае ее трансмембранной ориентации) или амфифильная - у белков, периферически взаимодействующих с мембраной [10, 11]. Основываясь на структурных данных с атомным уровнем разрешения, взаимодействие между а-спиралями и интерфейсом мембраны широко исследуют с помощью методов компьютерного моделирования [12]. Так, хорошее согласие результатов компьютерного моделирования с экспериментальными данными было получено для молекул, обладающих антибактериальной, фузи-онной или каналообразующей активностью, среди которых присутствуют как интегральные мембранные белки (грамицидин А [13], порины [14], бактериородопсин [15] и др.), так и периферические (фосфолипаза А2 [16], фузионные пептиды из гемагглютинина вируса гриппа [17] и др.).
В зависимости от способов учета эффекта растворителя (липидного бислоя) существует ряд подходов к моделированию мембранных белков, основанных на использовании эмпирических силовых полей. Наиболее перспективными среди них считаются модели с явно [18] и неявно заданным растворителем [19, 20]. Так, нами была разработана модель неявно заданной мембраны, где влияние растворителя учитывали путем добавления в функцию потенциальной энергии белка в "вакууме" специального терма, основанного на использовании эмпирических атомных параметров сольватации (АПС) [21]. Данный подход хорошо себя зарекомендовал в расчетах а-спираль-ных пептидов, взаимодействующих с мембраной [17, 19,21].
В то же время данных по моделированию мем-браносвязанных ß-структурных белков практически нет, что обусловлено прежде всего отсутствием структурной информации. Появление экспериментальных данных по пространственной структуре ЦТ2 в мицеллах (см. выше [8]) позволило охарактеризовать новый мотив связывания белков с бислоем - гидрофобные окончания ß-структурных петель. При этом расчет, выполненный с использованием модели неявно заданной мембраны, дал реалистичное описание взаимодействия ЦТ2 с бислоем, хорошо согласующееся с экспериментальными данными [22]. Очевидно, что исследование новых представителей семейства цитотоксинов, а также других ß-структурных мембраноак-тивных белков будет способствовать пониманию процессов, происходящих при их встраивании в мембрану.
В данной работе проведено теоретическое исследование взаимодействия с мембраной кардио-токсина А5. Этот ß-структурный белок, выделенный из яда тайваньской кобры Naja atra, относится к ЦТ Р-типа. Выбор токсина А5 обусловлен
Рис. 1. Пространственные структуры ЦТ А5, полученные с помощью РСА и спектроскопии ЯМР (а), и равновесные МД-структуры (б). Конформации совмещены по атомам основной цепи остатков, входящих в состав элементов вторичной структуры. Черным цветом показаны модели ЯМР0 и ЯМРмд, серым - РСА0 и РСАМД. Римскими цифрами (I, II, III) обозначены петлевые участки молекул. Дисульфидные связи для каждой модели показаны стержнями.
наличием для него двух моделей пространственной структуры, полученных с помощью рентге-ноструктурного анализа [23] и метода спектроскопии ЯМР [24]. Между моделями имеются существенные различия, особенно для первой и второй петель, где среднеквадратичное отклонение (СКО) по атомам основной цепи составляет 3-4 А.
Цели настоящей работы: 1) исследование кон-формационной подвижности ЦТ А5 в воде с помощью метода молекулярной динамики (МД); 2)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.