БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 5, с. 583 - 594
УДК 57.012.6
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛИНЕЙНЫХ КАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ С ФОСФОЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ И ПОЛИМЕРАМИ СИАЛОВОЙ КИСЛОТЫ*
© 2014 А.С. Кузнецов12**, П.В. Дубовский1, О.В. Воронцова1, А.В. Феофанов1, Р.Г. Ефремов1,3
1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10; факс: (495)336-2000
2 Московский физико-технический институт (государственный университет),
141700Долгопрудный Московской области, Институтский переулок, д. 9; факс: (495)408-4254; электронная почта: andrej.kuznecov@phystech.edu
3 Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики»,
101000 Москва, ул. Мясницкая, д. 20
Поступила в редакцию 27.12.13 После доработки 11.02.14
Полисиаловая кислота (ПСК) — природный полианион, широко представленный на наружной поверхности клеточных мембран. ПСК активно участвует в процессах передачи сигналов между клетками и межмолекулярных взаимодействиях, например, с пептидами и белками. Вместе с тем, при изучении антимикробной активности пептидов в качестве модельных мембран, как правило, используют липидные бислои, не содержащие ПСК, либо ее аналоги. Цель настоящей работы — исследование влияния ПСК на структуру и активность в отношении модельных биомембран мелиттина и латарцинов Пс1К и Пс2а — линейных катионных пептидов (ЛКП) из яда пчел и пауков соответственно. Рассматриваемые пептиды содержат по 26 аминокислотных остатков и обладают антимикробной активностью, но различаются характеристиками конформационной подвижности и гидрофоб-ности и имеют различный суммарный заряд. На основании анализа спектров кругового дихроизма показано, что указанные пептиды обладают склонностью к формированию а-спиральной структуры как в присутствии ПСК, так и при взаимодействии с липосомами, сформированными из цвиттерионных, анионных фосфолипидов или их смеси. Степень спирализации пептидов варьирует в зависимости от аминокислотной последовательности и свойств среды. На основании данных малоуглового рассеяния рентгеновского излучения и анализа параметров флуоресценции остатка Тгр мелиттина сделан вывод о формировании олигомерного комплекса а-спирального мелиттина с несколькими молекулами ПСК. В отличие от мелиттина, самого гидрофобного из данных пептидов, оба латарцина слабо взаимодействуют с цвиттерионными липосомами, но связываются с липосомами из анионных и из смеси цвиттерионных/анионных липидов. На смешанных липосомах Пс1К образует ассоциаты, включающие пептид в неупорядоченной либо в Р-структурной конформации. На липосомах остальных типов преимущественной конформацией всех исследованных пептидов является а-спираль. Показано, что ПСК способна ингибировать мембранолитическую активность мелиттина и латарцина Пс1К. Полученные данные указывают на то, что пептиды, благодаря своей конформационной лабильности, могут менять структурные и амфи-фильные свойства, используя, таким образом, различные сценарии взаимодействия с мембранами, на поверхности которых присутствуют анионные полисахариды. Этим объясняется сложность в понимании структурно-функциональных взаимосвязей при изучении взаимодействия ЛКП с биомембранами.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: линейные катионные пептиды, цитолитические пептиды, латарцины, мелиттин, фосфолипидные липосомы, сиаловая кислота, круговой дихроизм.
Электрический заряд, наряду с амфифиль-ностью — фундаментальные характеристики биомолекул, определяющие их активность in vivo.
Амфифильные пептиды с большим числом заряженных остатков, как правило, физиологически активны за счет способности взаимодействовать
Принятые сокращения: АМП — антимикробный пептид; ДОФХ — диолеоилфосфатидилхолин; ДОФГ — диолеоил-фосфатидилглицерин; ДОФЭ — диолеоилфосфатидилэтаноламин; КД — круговой дихроизм; ЛКП — линейный катион-ный пептид; ЛПС — липополисахарид; МРРИ — малоугловое рассеяние рентгеновского излучения; ПСК — полисиаловая кислота; LtclK — латарцин 1К из яда паука Laechesana tarabaevi; Ltc2a — латарцин 2А из яда паука Laechesana tarabaevi; Mlt — мелиттин, цитолитический пептид из яда медоносной пчелы Apis melífera.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-360, 13.04.2014.
** Адресат для корреспонденции.
с рецепторами и другими компонентами биомембран [1, 2]. В частности, поликатионные пептиды рассматриваются как перспективные молекулы для антибактериальной и противораковой терапии [3, 4]. Такие пептиды широко представлены в ядах насекомых, паукообразных и змей [5, 6]. Они бывают компактными с высокостабильными структурами из-за присутствия дисуль-фидных связей, как, например, кардиотоксины [7, 8]. Антиподом последних являются линейные пептиды без дисульфидных связей — они характеризуются высокой подвижностью и, как правило, способностью переключения между рядом состояний [9, 10]. В данной работе мы исследовали амфифильные пептиды с высокими значениями суммарного положительного заряда — линейные катионные пептиды (ЛКП).
К числу ЛКП принадлежат латарцины LtclK [11] и Ltc2a [12], выделенные из яда среднеазиатского паука Laechesana tarabaevi [13, 14], и ме-литтин из яда медоносной пчелы Apis melifera [15]. Эти пептиды (табл. 1) имеют одинаковую длину, но их суммарный заряд различен и варьирует от +5 (мелиттин) до +10 (оба латарцина).
Указанные пептиды обладают широким спектром антибактериальных свойств и являются токсичными для опухолевых клеток различной этиологии [17, 18]. Предполагается, что данные виды активности обусловлены способностью пептидов взаимодействовать с липид-ными мембранами, содержащими анионные фосфолипиды, формируя при этом амфифиль-ные а-спирали [4, 11, 12]. Гидрофобные/гидрофильные свойства таких спиралей оказываются неодинаковыми для разных пептидов, что в некоторых случаях объясняет механизм разрушения целевой липидной мембраны и различие их активностей в отношении различных штаммов бактерий. С другой стороны, воздействием ЛКП на одну лишь липидную компоненту мембраны нельзя объяснить весь спектр биологической
активности пептидов при взаимодеиствии с различными клетками. Например, эффект ЛКП на грамотрицательные бактерии в значительной степени объясняется способностью пептидов проникать через липополисахаридный слой (ЛПС), предохраняющий плазматическую ли-пидную мембрану этих бактерий от внешних воздействий [19—21]. Для клеток животных одним из полимеров, присутствующим на поверхности клеточной мембраны, является полисиа-ловая кислота (ПСК) [22, 23]. ЛПС и ПСК характеризуются периодическим распределением отрицательно заряженных групп, поэтому взаимодействие с такими полимерами может модулировать воздействие на клетку ЛКП и определять селективность их антибактериального действия [24]. Описано связывание мелиттина с гепарином, гепаринсульфатом и дерматансуль-фатом — полианионами, которые также часто встречаются на поверхности клеток, и предложена модель взаимодействия мелиттина с ними [25]. Для латарцинов такие модели отсутствуют.
Цель настоящей работы — изучение взаимодействия ЛКП (мелиттина и латарцинов Ые1К и Ые2а) с фосфолипидными мембранами в присутствии полисиаловых кислот и без них. Были решены следующие задачи: оценено влияние ПСК различной молекулярной массы на вторичную структуру данных пептидов, исследована возможность образования стабильных ассоциатов этих пептидов с ПСК, проанализированы различия между этими тремя пептидами, изучено влияние ПСК на мембранолитическую активность данных ЛКП. Также исследовали изменение пространственной структуры пептидов при взаимодействии с липосомами различного фос-фолипидного состава. Полученные данные проливают свет на свойства пептидов, определяющие их взаимодействие с конформационно гибкими полианионными полимерами (ПСК) и фосфолипидными мембранами.
Таблица 1. Поликатионные пептиды, использованные в работе, и их свойства
Пептид Аминокислотная последовательность Длина Заряд Гидрофобность/ гидрофобный момент* Гидрофильная/ гидрофобная площадь (%) PDB код
Мелиттин (mlt) GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 26 +5 -0,08/0,27 55/45 2MLT
Латарцин Ltc1K SMWSGMWRRKLKKLRNALKKKLKGEK 26 + 10 -0,45/0,33 61/39 2PCO
Латарцин Ltc2a GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH 26 + 10 -0,23/0,31 56/44 2G9P
* Значение среднего индекса гидрофобности и величина гидрофобного момента даны по шкале Эйзенберга с соавт. [16].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. В работе использовали полисиа-ловую кислоту двух молекулярных масс: 6,9 и 22,9 кДа (обозначены как ПСК-7 и ПСК-23 соответственно) производства «FDS Pharma», Великобритания. Латарцины Ые1К и Ltc2a синтезированы твердофазным методом [13]. Чистота мелиттина (более 95%), выделенного из яда пчел, подтверждена электрофорезом в ПААГ и гель-проникающей хроматографией. Поли-L-лизин (15—30 кДа), полиэтиленимин (700 кДа), липиды диолеилфосфатидилхолин (ДОФХ), ди-олеилфосфатидилэтаноламин (ДОФЭ) и диоле-илфосфатидилглицерин (ДОФГ) были производства «Avanti Polar Lipids», США.
Деионизированная вода получена с использованием установки «Millipore» (Франция). В работе использовали соли производства «Fluka» (Швейцария) и ч.д.а. «Реахим» (Россия). Применяли следующие буферные растворы: PBS (1,7 мМ KH2PO4, 5,2 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl), pH 7,3; 0,1 М цитратный буфер (лимонная кислота — цитрат натрия в различных соотношениях), рН 3,2-6,0; 50 мМ HEPES-NaOH («ПанЭко», Россия), pH 7,0.
Круговой дихроизм. Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали при комнатной температуре на спектрополяриметре J-810 («Jasco», Япония) в пределах 190-250 нм с шагом 0,2 нм в кювете с длиной оптического пути 0,1 мм. Использовали растворы пептидов, ПСК и смесей пептидов с ПСК в воде, PBS, HEPES и цитратном буферах. Концентрация латарцинов составляла 0,3 мМ (0,1 мМ для Ltc2a в PBS), мелиттина — 0,175 мМ. Концентрацию ПСК-23 варьировали в пределах 0,04—0,30 мМ, ПСК-7 — в пределах 0,15—0,60 мМ. Из спектров смесей пептидов с ПСК вычитали спектры ПСК соответствующей концентрации. Оценку содержания элементов вторичной структуры пептидов проводили с помощью программ Selcon3, Cdsstr
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.