ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 461, № 5, с. 599-603
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 575:579.842.11
взаимодеиствие мессенджеров - "газотрансмиттеров" no и h2s в сигнальных и регуляторных процессах
бактериальной клетки
© 2015 г. С. В. Васильева, Д. А. Стрельцова
Представлено академиком РАН А.А. Берлиным 16.06.2014 г. Поступило 16.06.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565215110249
Газы играют огромную роль в жизни биосистем. У млекопитающих особое значение приобрели малые молекулы — N0, СО и И28, как регуляторы сосудистого тонуса и медиаторы воспалительного процесса [1, 2].
Малые молекулы с функциями мессенджеров — N0, СО и И28, — называемые в настоящее время "эндогенными газотрансмиттерами", энзиматиче-ски генерируются и регулируются во всех биосистемах. В низких концентрациях эти соединения осуществляют ключевые сигнальные и регуляторные функции, включая контроль формирования биопленок резистентности к антибиотикам у бактерий. Кроме того, для бактериальных клеток сероводород — существенный метаболический элемент нормального процесса питания.
Газотрансмиттеры токсичны в высоких концентрациях, поражая ряд ключевых мишеней, в частности, митохондриальную цитохромоксида-зу, моноаминоксидазу и др. [3].
В выявлении фундаментальных механизмов биогенеза, метаболических, сигнальных и регуля-торных функций наиболее детально изучен оксид азота. В сравнении с ним физиологическая роль и генетические функции Н28 и особенно СО изучены слабо.
Существенно, что все "эндогенные газотрансмиттеры" свободно проходят через клеточные мембраны, и их эффекты не зависят от наличия родственных мембранных рецепторов. В соответствии с рецепторнезависимым сигнальным механизмом закономерен вопрос о необходимости пересмотра консервативной доктрины клеточной сигнальной трансдукции для соединений этого класса.
Эндогенный синтез сероводорода из аминокислот цистеина и гомоцистеина в клетках мле-
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской Академии наук, Москва E-mail: svasilieva@polymer.chph.ras.ru
копитающих и большинства изученных видов бактерий — многоэтапный процесс с участием разных сочетаний из 1—3 ферментов [3, 4].
Сероводород функционирует как медиатор воспалительного процесса у мышей. Его уровень резко возрастает при инъекции животным бактериального липополисахарида, что коррелирует с аналогичным эффектом хорошо изученного медиатора воспалительного процесса — оксида азота [5]. Активная физиологическая форма для H2S пока не установлена. Поскольку H2S является потенциальным перехватчиком пероксинитрита [6], существует предположение, что H2S in vivo может прямо взаимодействовать с NO * и с другими активными формами азота (RNOS), изменяя, таким образом, трансмиттерные функции обоих компонентов и их комплексов.
В представленной работе впервые на живых бактериальных клетках Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa было изучено участие мессенджеров — эндогенных "газотрансмиттеров" NO и H2S в сигнальных и регуляторных процессах, связанных с защитой клеток от стрессов.
Целью нашей работы было изучение сигнальных и регуляторных функций H2S в защите клеток от стрессов при взаимодействии H2S с главной сигнальной молекулой NO. Мы впервые представили доказательства, что в регуляции нит-розативных повреждений в ДНК, индуцирующих активацию регулона SoxRS, и при формировании биопленок резистентности малые молекулы NO и H2S могут функционировать согласованно, взаимно дополняя друг друга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Водные растворы NO-доноров — S-нитрозо-глутатиона (GSNO) и динитрозильного комплекса железа с глутатионовым лигандом (ДНКЖ-глу) получены по методу Ванина [7]. В работе исполь-
Уровень экспрессии гена sfiA, ед. Миллера 120
100 80
60 40 20
Ь НЕ
ь л
о &
н
о
.6 2.
О
X
я
4
М М М М S М s М S М s М
to to to to to to
0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0.
о £ t/5 Ü у л г 1 t/3 св £ t/3 я св £ t/3 св £ + t/3 я св £ t/3 ce £ + t/3 Я св £
to
0.
о £
Ü
to
0.
О
£
t/5
Ü
0. >>
л г
0. >>
л
0
Рис. 1. Экспрессия гена sfiA (SOS-регулон) в штамме E. coli PQ37 [sfiA::lacZ\. Здесь и на рис. 2 и 3 — M± 95%-е доверительные интервалы, n = 4.
зовали доноры H2S — Na2S и NaHS • 2H2O ("Хим-мед", Россия).
Ку л ь т у р ы бактерий. В работе исследовали штаммы E. coli PQ37 и TN530, содержащие в составе хромосомы конструкции слитых оперо-нов [sfiA::lacZ\ и [soxS::lacZ] соответственно [7, 8]. В этих штаммах структурный ген ß-галактозида-зы lacZ находится под контролем промоторов генов sfiA (SOS-регулон)/soxS (soxRS-регулон), а в геноме присутствует делеция хромосомного Lac-оперона. Таким образом, о величине экспрессии генов sfiA/soxS судят, измеряя активность ß-га-лактозидазы в колориметрическом тесте по методу Миллера [9]. Хромоген для ß-галактозидазы — о-нитрофенил^^-галактопиранозид (ONPG, "Sigma", США). В качестве положительного контроля экспрессии гена sfiA SOS-регулона использовали 4-нитрохинолина оксид (4НХО, 2.63 нМ).
Для инактивации и связывания активных форм кислорода и азота (ROS/RNOS) использовали 50 мМ водный раствор тиомочевины ("Sigma").
Формирование бактериальных б и о п л е н о к исследовали в соответствии с методикой [10]. Для этих целей использовали клетки P. aeruginosa. Позитивным контролем в тестах являлась обработка клеток ципрофлоксацином (CF, "Sigma").
ЭПР-исследования проводили на клетках E. coli. Клеточную суспензию центрифугировали (4000 об./мин), полученный осадок разводили 0.5 мл супернатанта. Далее клетки замораживали в жидком азоте. Спектры ЭПР регистрировали с помощью модифицированного радиоспектрометра фирмы "Радиопан" (Польша) при 77 K (амплитуда высокочастотной модуляции магнитного поля — 0.2 мТ, мощность поля СВЧ — 5 мВт).
Статистический анализ экспериментальных результатов проведен с помощью пакета программ М1сг080Й Ехсе1 и OriginPro 7.0. Результаты представлены в виде средних значений четырех экспериментов и 95%-х доверительных интервалов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оба исследуемых донора N0 — С8МО и ДНКЖ-глу — в сублетальной концентрации 0.5 мМ вызывали 1.5-2-кратное увеличение экспрессии генов E.coli sfiA и soxS по сравнению со спонтанным фоном (рис. 1 и 2). Эквимолярные растворы сульфидов №28 и не оказывали
ни токсического, ни генотоксического влияния (рис. 1 и 2).
ВЗАИМОДЕИСТВИЕ МЕССЕНДЖЕРОВ
601
Уровень экспрессии гена soxS, ед. Миллера 60
50 40 30 20 10
0 н о и
ади
н е
.5 0.
О £
Ü
М М М М М М М
.5 .5 .5 .5 .5 .5 .5
0. 0. 0. 0. 0. 0. 0.
>> 5 1 С/3 2 св £ С/3 я св £ С/3 2 св £ С/3 я св £ С/3 2 св £ С/3 я св £
Д
.5 0.
О £
Ü
.5 0.
О £
Ü
.5 0.
>> 5
Д
.5 0.
>> л
Д
0 5
.5 0.
р
о н
о д
I
О £
0 5
.5 0.
С/3
2
св £
.5 0.
р
о н
о д
I
О £
0 5
.5 0.
н о и
ади
н е
Рис. 2. Экспрессия гена soxS (SoxRS-регулон) в штамме E. coliTN530 [soxS::lacZ].
0
Мы не обнаружили изменений в величине экспрессии гена sfiA в исследуемых штаммах при совместной обработке клеток в течение 60 мин известными SOS-индукторами (NO-доноры) и каждым из изученных сульфидов при сравнении с обработкой только NO-донорами (рис. 1).
Однако в системе защитного SoxRS-регулона E. coli мы наблюдали значительное избирательное увеличение экспрессии гена soxS в вариантах сочетания любого из NO-доноров (GSNO, ДНКЖ-глу) с Na2S по сравнению с уровнем экспрессии, индуцируемым NO-донорами без сульфида натрия (рис. 2). Эти результаты могут указывать на рост нитрозативных повреждений в клеточной ДНК вследствие увеличения объема генотоксич-ных радикалов ROS/RNOS при суммарной обработке клеток NO-донор + Na2S.
В пользу указанного предположения свидетельствуют результаты серии опытов по изучению уровня экспрессии гена soxS с предобработкой клеток тиомочевиной — ловушкой радикалов ROS/RNOS (рис. 2). Во всех группах, включая по-
ложительный контроль (добавление менадиона), уровень экспрессии гена soxS снижался до спонтанного. Сходные результаты были получены и в работе [11].
Клетки Р. aeruginosa мы использовали при изучении влияния Na2S и NaHS на формирование биопленок резистентности при инкубации клеток в течение 24 ч с эквимолярными 0.5 мМ растворами доноров NO — ДНКЖ-глу и GSNO (рис. 3). В качестве положительного контроля мы применили фторхинолон CF в концентрации 0.05 мкМ. В бактериальных клетках фторхиноло-ны контролируют процессы репликации и репарации ДНК, связываясь с комплексом ДНК-ги-разы/топоизомеразы и придавая этому комплексу функции эндонуклеазы с последующими формированием двунитевых разрывов ДНК и гибелью клетки.
Сублетальные растворы эндогенных газотрансмиттеров в 1.5—2 раза ингибировали рост массы биопленок P. aeruginosa по сравнению с контрольным уровнем, что соответствовало активности CF (рис. 3). Однако комбинированная
Оптическая плотность 0.9
ь л о М М М М
тр .5 .5 .5 .5
н 0. 0. 0. 0.
о а С/3 св £ С/3 я св £ у л г 1 О £ t/5 Ü
Я
а
ъ
у
глу
Я
а
ъ
о £
Ü
to
0
.0 0.
и
.0 0.
ь
и
Рис. 3. Уровень биомассы биопленок резистентности в клетках P. aeruginosa при раздельной и суммарной инкубации клеток с NO-донором или NO-донором + H2S.
g = 2.04
g = 2.014
330
335
340
Рис. 4. Спектры ЭПР, зарегистрированные при 77 K в клетках E. coli TN530 после обработки: (1) NO-донор — "широкий" сигнал (g = 2.03) и (2) NO-донор + Na2S — "узкий" сигнал (g = 2.03). Относительное усиление спектрометра — 2 для спектра 1 и 1 для спектра 2.
обработка клеток ДНКЖ-глу + или GSN0 +
+ в 3—3.5 раза увеличивала массу биопленок по сравнению с обработкой только донором N0 (рис. 3).
Увеличение показателей экспрессии soxS и биомассы биопленок в вариантах с обработкой клеток N0 + Н^ коррелировало с ростом количества внутриклеточных белковых динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) с персульфидными ли-гандами, зарегистрированным с помощью ЭПР-спектроскопии (рис. 4). В клетках, обработанных N0-донорами, формировались ДКЖ с "широким" тиоловым сигналом в ЭПР-спектре с ^-фактором, равным 2.03 = 2.04, = 2.014, рис. 4, 1). Дополнительное внесение при инкубации клеточной суспензии с донором N0 изменяло "широкий" сигнал ЭПР на "узкий" персульфидный сигнал с gcp = 2.03 (^ = 2.032, = 2.020, рис.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.