АГРОХИМИЯ, 2009, № 1, с. 62-67
УДК 579.887.121:633.311:579.841.31:631.847.21
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКОПЛАЗМЫ Acholeplasma laidlawii С СИМБИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМОЙ Medicago sativa-Rhizobium meliloti
© 2009 г. А. А. Ванькова, П. И. Иванов
Российский государственный аграрный университет -Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева 127550 Москва, Тимирязевская ул., 49, Россия E-mail: mbiol@timacad.ru Поступила в редакцию 30.05.2008 г.
Приведены результаты экспериментальных исследований влияния микоплазмы Acholeplasma laidlawii -широко распространенной в природе ультрамикроскопической бактерии, вызывающей заболевание (микоплазмоз) люцерны, на формирование и эффективность бобово-ризобиального симбиоза. Разработана лабораторная модель взаимодействия растений, микоплазм и клубеньковых бактерий. Методами световой и электронной микроскопии выявлены морфологические изменения корневых волосков и клубеньков люцерны при инфицировании микоплазмой. Влияние A. laidlawii на гомеостатичную симбио-тическую систему Medicago sativa-Rhizobium meliloti выражалось в задержке инфицирования ризобиями растения-хозяина и стимулировании нитрогеназной активности сформировавшейся системы.
ВВЕДЕНИЕ
На всех этапах формирования биосферы азотфик-сация служила источником азота для живыж существ, хотя доля биологического азота, по данныш [1], не превышает 0.0007% от его общих запасов на Земле. Согласно имеющимся оценкам, микроорганизмы в наземных экосистемах ежегодно фиксируют 175-190 млн. т молекулярного азота, из которых 99-110 млн. т - азотфиксаторы в почвах сельскохозяйственных угодий [2]. Существенный вклад в поступление азота в почву вносят растительно-микробные системы, в частности, симбиотические. Бобовые растения являются примером возникновения качественно новых признаков, поскольку в результате взаимодействия ранее независимые партнеры - растение и клубеньковые бактерии создают бобово-ризобиальную систему, в которой для развития последних создается особая среда. В случае микоплазменной контаминации Acholeplasma laidlawii в системе, прежде всего в микробной части, происходят изменения, влияющие на симбиоз в целом.
Ранее нами было показано [3, 4], что микоплазмы могут проникать в растения люцерны через корневую систему, мигрировать в надземные части растений, длительно персистировать в них, вызывая характерные морфологические изменения. Выявлено, что A. laidlawii оказывает стимулирующий эффект на растения, способствуя их более интенсивному росту и развитию. В связи с этим исследование влияния микоплазм на симбиотическую систему представляет несомненный интерес и имеет практическое значение.
Цель работы - изучение влияния A. laidlawii на формирование и нитрогеназную активность бобо-во-ризобиального симбиоза Medicago sativa-Rhizobium meliloti.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В опытах использовали люцерну посевную Medicago sativa, микоплазму A. laidlawii (штамм А, из коллекции ВНИИ микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалея РАМН, Москва) и клубеньковые бактерии R. meliloti (штамм 425а, из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург).
Для постановки опыта семена люцерны стерилизовали по методу Натмана [5] концентрированной серной кислотой в течение 3-4 мин и проращивали при комнатной температуре. Проростки люцерны в стерильных условиях переносили в опытные сосуды на поверхность полужидкой (0.6% агара) питательной среды и подращивали их в течение 2 нед при 12-часовом световом дне, температуре 20-22°С и освещенности 4 кЛк. Через 2 нед растения инокулировали путем внесения в питательную среду суспензии клубеньковых бактерий из расчета 1.8 х 108 КОЕ и микоплазм 1.6 х 106 КОЕ/растение. В каждом сосуде выращивали по 1 растению. Контроль - растения люцерны, не зараженные микоплазмами.
Процесс инфицирования и образования клубеньков наблюдали в динамике с помощью световой микроскопии. Для изучения клубеньков и утолщений на корнях люцерны использовали сканирующую электронную микроскопию [6]. Нитрогеназ-
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКОПЛАЗМЫ АсНо1ер1а8та ШМШпи
63
ную активность симбиозирующих растений определяли ацетиленовым методом [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для решения поставленной задачи было необходимо разработать лабораторную модель взаимодействия растений, микоплазм и ризобий, так как до настоящего времени все данные о характере взаимоотношений микоплазм с растениями были получены на основании полевых и вегетационных опытов. Связано это было с отсутствием питательной среды, на которой одновременно могли бы развиваться и микоплазмы, и растения.
Для их совместного культивирования впервые была использована питательная среда на основе растительного экстракта с добавлением витамина В12, которая была разработана нами и успешно использовалась для выделения микоплазмопо-добных микроорганизмов из почвы [8]. При посеве А. ШМам>и (штамм А) на плотную питательную среду через 7-10 сут на ее поверхности наблюдались типичные для микоплазм колонии диаметром 0.5-1.5 мм. Рост растений люцерны в условиях стерильного опыта удавалось поддерживать на этой среде до 8 мес.
Была также проверена способность развития на среде клубеньковых бактерий и выяснен характер влияния на них микоплазм при совместном культивировании. Я. швШой (штамм 425 а) высевали по стандартной методике. Через 3 сут инкубирования при 20-22°С на поверхности среды образовывались характерные колонии ризобий. Совместный посев микоплазм и клубеньковых бактерий газоном на питательную среду показал (рис. 1а, б), что бактерии не оказывали видимого влияния друг на друга: форма колоний оставалась неизменной, в ряде случаев наблюдали рост микоплазм на поверхности колоний ризобий также без изменения формы последних. На основании этих результатов предположили, что микоплазмы не должны подавлять культуру ризобий на стадии формирования бобово-ризоби-ального симбиоза.
Таким образом, питательная среда на основе растительного экстракта оказалась пригодной для культивирования микоплазм, люцерны и клубеньковых бактерий и позволила совместить эти три биологических объекта в единую лабораторную модель для изучения особенностей формирования клубеньков и эффективности бобово-ризо-биального симбиоза.
При инфицировании растений люцерны суспензией Я. швШой (штамм 425 а) первые специфически искривленные корневые волоски в виде "ручки зонтика" появились через 7 сут (рис. 1в, е) на главном корне, но их было немного (не более 5-6 шт.), располагались они примерно в зоне 1.4-
1.7 см от конуса нарастания при общей длине корня 4-5 см. Число корневых волосков с характерным искривлением кончиков оставалось практически неизменным в течение опыта. Как правило, в природных условиях и при выращивании в лабораторных условиях на бобовом агаре корневые волоски одноветвистые, в наших опытах преобладали двуветвистые и иногда встречались даже трехветвистые, причем искривление отмечалось только у одного из ответвлений (рис. 1д). Мы полагаем, что ветвистость корневых волосков была вызвана использованием новой питательной среды. На 15-е сут на главном корне специфически искривленных корневых волосков практически не было - центр инфицирования переместился на боковые корни, располагающиеся в верхней части корневой системы. Первые единичные клубеньки образовались в данном варианте опыта на 13-е сут культивирования.
В варианте совместного внесения ахолеплазм и ризобий в среду с предварительно асептически выращенной люцерной первые инфицированные волоски появились только на 23 сут, то есть значительно позднее, чем в контрольном варианте (без ахолеплазм) (рис. 2). Их количество было в 4-5 раз меньшим, чем в контроле и наблюдались они только на главном корне. На 11-е сут, вокруг главного корня отмечено характерное помутнение питательной среды в виде "белого облака", связанное с развитием ахолеплазм и затрудняющее подсчет корневых волосков (рис. 1г). Первые клубеньки у растений люцерны, зараженных ахолеплазма-ми и клубеньковыми бактериями, появились лишь на второй месяц культивирования. Более позднее появление инфицированных корневых волосков и меньшее их число, значительная задержка в формировании клубеньков свидетельствовали о том, что микоплазмы тормозят процесс инфицирования растения-хозяина ризобиями.
Клубеньки контрольных (зараженных только ризобиями) и инфицированных ризобиями и ахо-леплазмами растений отличались не только сроками появления, но и внешним видом, в частности структурой поверхности клубенька. Особенно отчетливо это выявляется при электронномикро-скопическом сканировании (рис. 3а, б, в).
Поверхность клубеньков контрольных растений имела довольно четкую складчато-ячеистую структуру с вмятостями (уплощениями, вдавлен-ностями) по центру или по продольным линиям. У растений, зараженных ризобиями и ахолеплазма-ми, вмятости в ряде случаев сохранялись, но общий вид поверхности клубенька совершенно изменялся. Вместо ячеистости клубеньки покрывались чашеобразными лепестками: ячейки как бы разорвались, и каждая выглядела отдельным чашелистиком, располагающимся под углом к поверхности клубенька. Такая способность к дефор-
Рис. 1. Вид колоний А. ШЛанги штамма А (мелкие округлые) (а) и Я. швШой штамма 425а (б) при совместном культивировании на питательной среде; специфически искривленные корневые волоски люцерны (в, е); эффект "белого облака" вокруг корня (г); ветвистость корневых волосков (д). Размер масштабной линейки - 0.5 мм.
мации клубеньков, возможно, связана с поражаемо-стью их поверхности микоплазмами, которые концентрируются вокруг корня. Известно [9, 10], что наличие капсул способствует прикреплению микоплазм к клеткам эукариот и определяет их токсические эффекты. Можно также предположить, что наблюдаемые изменения имеют иные, более глубокие причины и объясняются физиологическими процессами, которые возникают в клетках растений при инвазии микоплазм в корневую систему.
На 21-22 сут на боковых корнях растений, инфицированных ризобиями и А. 1аШ1ами, наблюдали вздутия (утолщения), имеющие гладкую поверхность и слизистую, аморфную структуру (рис. 3г).
Задержка в процессе инфицирования сказалась и н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.