УДК 577.121.7
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА (МВР) И ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 2,3-ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ (С№азы) С МИТОХОНДРИЯМИ
© 2014 Ю.Л. Бабурина*, А.Е. Гордеева, | Д.А. Мошков] , О.В. Крестинина, А.А. Азарашвили, И.В. Одинокова, Т.С. Азарашвили*
ФГБУНИнститут теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино Московской обл.; факс: (4967)330-553, электронная почта: azartam@yandex.ru, byul@rambler.ru
Поступила в редакцию 11.12.13 После доработки 24.02.14
Во фракциях митохондрий мозга, полученных после их разделения на градиенте плотности РегсоИ (миели-новая фракция, синаптические и несинаптические митохондрии), определено содержание и распределение основного белка миелина (изоформы 21,5 и 17 кДа) и 2'3'-циклонуклеотид-3,-фосфодиэстеразы (СМРазы). Все фракции способны накапливать Са2+ и поддерживать мембранный потенциал, а в ответ на пороговую концентрацию кальция инициировать открытие неселективной поры. В миелиновой фракции обнаружены нативные митохондрии и контакты между мембранами митохондрий и миелина. Методом иммунноблот-тинга показано, что при добавлении миелиновой фракции мозга к суспензии митохондрий печени, СМРаза и МВР, присутствующие в миелиновой фракции, способны связываться с митохондриями печени в условиях открытой и закрытой неселективной поры. Однако индукция открытия мРТР в митохондриях печени в присутствии миелиновой фракции мозга предотвращается, т.е. уменьшается скорость выхода Са2+ в 1,5 раза, увеличивается время удержания Са2+ в два раза и снижается амплитуда набухания в 2,8 раза. Полученные результаты указывают на протекторные свойства СМРазы и МВР.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрии, неселективная пора, основной белок миелина, фосфодиэстераза 2',3'-циклических нуклеотидов.
Д.А. Мошков
В настоящее время установлено, что митохондрии участвуют в клеточной гибели и играют ключевую роль в выживаемости клеток мозга. Обнаружено, что программируемая гибель нейронов и других клеток мозга происходит как при остром повреждении мозга (ишемия, травма, инфекции ЦНС), так и при хронических заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, Пар-кинсона, а также при старении. Показано, что в процессы гибели нейрональных клеток при нейродегенеративных заболеваниях вовлекаются апоптоз, некроз и аутофагия [1], и в этих условиях обнаружен высокий процент поврежденных митохондрий [2, 3]. Известно, что ней-родегенеративные изменения сопровождаются нарушением целостности миелиновой оболоч-
Принятые сокращения: МФАМ — миелиновая фракция, ассоциированная с митохондриями, мРТР — неселективная митохондриальная пора.
* Адресат для корреспонденции.
ки, которая представляет собой мембранную структуру, защищающую аксон и обеспечивающую распространение электрических импульсов на большие расстояния с высокой скоростью. Миелиновая мембрана отличается от других биологических мембран высоким соотношением липид/белок и наличием специфических белков, среди которых протеолипид миелина (РЬР), основной белок миелина (МВР) и 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстераза (СМРаза) являются мажорными белками. В последние годы возрос интерес к локализации и роли миели-новых белков вне миелиновой оболочки и, в частности, их взаимодействию с митохондриями. Присутствие миелиновых белков в немие-линизированных тканях, таких как печень, почки, поджелудочная железа, кровь и церебральная жидкость было описано ранее [4—7]. Показано также, что СМРаза, МВР и РЬР связываются с митохондриями немиелизированных тканей [5, 6, 8]. Пока мало понятна роль ассоциа-
ции этих белков, как для митохондрий, так и для клетки в целом, однако остается бесспорным тот факт, что эти три миелиновых белка играют вне миелина особые, пока неизвестные функции [4—6, 8, 9]. Недавно, в митохондриях, изолированных из мозга, печени и олигодендроци-тов была идентифицирована фосфодиэстераза, гидролизующая 2',3'-циклонуклеотиды (СМРаза) и было выявлено ее участие в регуляции неспецифической поры (мРТР). В частности, было показано, что снижение экспрессии СМРазы приводит к уменьшению пороговой концентрации кальция, необходимой для индукции открытия неселективной поры, а субстраты СМРазы (2',3'-сАМР и 2',3'-cNADP) способны ускорять открытие мРТР [9]. Другой белок миелина — МВР был также обнаружен в тканях, не содержащих миелин, т.е. в печени, почках и легких [5, 6]. Методом иммунной электронной микроскопии в клетках поджелудочной железы была показана ассоциация МВР с митохондриями [7]. МВР был детектирован во внешней и внутренней мембранах, а также в кристах митохондрий.
Ассоциация миелинового протеолипида (PLP) с митохондриями была показана как in vitro, так и in vivo методом конфокальной микроскопии [8,10]. В исследовании было продемонстрировано, что PLP в клетках COS7 может встраиваться во внутреннюю митохондриальную мембрану. Авторы отмечают, что протеолипид на Л-конце содержит мотивы, позволяющие ему солокали-зоваться с митохондриями. Удаление (делеция) первых 10—20 аминокислотных остатков на Л-кон-це протеолипида приводит к потере способности PLP взаимодействовать с митохондриями [8]. В связи с этим, интересно отметить, что в составе PLP присутствует последовательность субъединицы «с» Fo-сектора митохондриальной FoF1— ATP-синтетазы [11, 12], которая может вовлекаться в функционирование неспецифической поры [13—17]. Следует отметить, что, несмотря на многолетние исследования неселективной митохондриальной поры, ее структурный состав и механизм регуляции ее функционирования до конца еще не установлены. Тем не менее, при исследовании механизмов регуляции функционирования неспецифической поры в митохондриях, нами был обнаружен новый молекулярный механизм ее регуляции, основанный на процессе Са2+-зависимого фосфорилирования/дефос-форилирования митохондриальных мембран-но-связанных белков с молекулярными массами 44—46, 21,5, 17 и 3,5 кДа, статус фосфорили-рования которых изменялся при индукции открытия неселективной поры [13—16]. К настоящему моменту эти фосфобелки идентифицированы. Среди них фосфобелок с молекулярной
массой 46 кДа был идентифицирован в высоко-очищенных митохондриях мозга крыс как 2',3'-циклонуклеотид-3'-фосфодиэстераза (СМРаза) [9], а фосфопептид (мол. масса 3,5 кДа) был детектирован как гидрофобная субъединица «с» мембранного Fo-сектора АТР-синтетазы [13, 16]. Совсем недавно в препаратах митохондрий мозга, которые не подвергались разделению в градиенте плотности Регео11 методом двумерного электрофореза с последующей масс-спектромет-рией, были идентифицированы две фосфоизо-формы МВР (17 и 21,5 кДа) [18]. Однако роль этих белков в митохондриях не была изучена.
В настоящей работе во фракциях митохондрий мозга, полученных после их разделения в градиенте плотности Регео11, были исследованы способность к активации открытия неселективной поры (мРТР) и распределение миелиновых белков (СМРазы и МВР). С помощью миелино-вой фракции, полученной при выделении митохондрий мозга как источника миелиновых белков, было изучено влияет ли связывание миелиновых белков (СМРазы и МВР) с митохондриями на индукцию открытия неселективной поры митохондрий.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение митохондрий из мозга крыс. Митохондрии мозга крысы (ЯВМ) выделяли по методу Симса, модифицированному в нашей лаборатории [19]. В эксперименте использовали самцов линии М^аг (200—250 г). Крыс декапи-тировали, мозг быстро извлекали и охлаждали в ледяном физиологическом растворе, гомогенизировали при 0—4° в десятикратном объеме среды (320 мМ сахарозы, 10 мМ Тт-НС1, рН 7,4, 0,5 мМ К+-ЭДТА, 0,5 мМ К+-ЭГТА, 0,2%-ного БСА). Гомогенат центрифугировали при 2000 g в течение 3 мин, осадок удаляли, а супернатант центрифугировали повторно для более полного осаждения ядер и поврежденных клеток. Супер-натант центрифугировали при 4° при 12 500 g в течение 10 мин для осаждения митохондрий. Митохондрии (1,5 мл) смешивали с 3%-ным Регео11 (1 мл), наслаивали для получения мито-хондриальных фракций на градиенте плотности Регео11 (10—15—24%) и центрифугировали при 31 500 g в течение 10 мин. Осадок несинаптичес-ких митохондрий, синаптических митохондрий и миелиновой фракции промывали средой выделения без ЭДТА, ЭГТА и БСА при 11500 g 10 мин и суспендировали в той же среде.
Выделение митохондрий из печени крыс проводили по стандартной методике. Изолированную печень гомогенизировали при 0—4° в деся-
тикратном объеме среды (220 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭГТА, 0,05%-ного БСА). Гомогенат центрифугировали при 800 g 10 мин для осаждения ядер и поврежденных клеток. Супернатант, содержащий митохондрии, центрифугировали для их осаждения (9000 g 10 мин). Полученные митохондрии промывали средой, не содержащей ЭГТА и БСА, при 9000 g 10 мин и суспендировали в той же среде.
Определение митохондриальных функций. Изменение мембранного потенциала митохондрий и концентраций ионов кальция измеряли в тер-мостатируемой ячейке, в которую вмонтированы селективные электроды: ТРР+ и Са2+ как описано ранее [9]. Среда инкубации содержала 10 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 120 мМ KCl, 0,4 мМ KH2PO4, 5 мМ сукцината калия, 2,5 мкМ роте-нона. В качестве субстрата для дыхания митохондрий использовали сукцинат калия. Концентрация белка в ячейке составляла 1 мг/мл. Открытие мРТР в митохондриях индуцировали добавлением кальция до достижения его пороговой концентрации, необходимой для инициации открытия мРТР. Каждое добавление Са2+ составляло 100 нмоль на мг белка. Все эксперименты были выполнены в открытой ячейке.
Определение набухания митохондрий мозга и печени крысы осуществляли по кинетике светорассеяния суспензии митохондрий при длине волны 540 нм с помощью спектрофотометра ПЭ-5400В (Россия) при 25° в изотонической среде, содержащей 10 мМ Tris-HCl-[1 М]-буфер, pH 7,5, 125 мМ KCl [1 М], 2 мМ KH2PO4 [1 М], 5 мМ сукцинат калия, 2,5 мкМ ротенона [2,5 мМ]. Концентрация белка в кювете составляла 1 мг белка/мл для митохондрий печени и 0,4 мг белка/мл для митохондрий мозга.
Электрофорез и Вестерн-блот. Электрофорез в денатурирующих условиях проводили в мини-камере (Hoefer) по методу Лэммли [20]. На каждую дорожку геля нанос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.