научная статья по теме ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛНОСТЬЮ-ТРАНС-РЕТИНАЛЯ С БИСЛОЙНЫМИ ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛНОСТЬЮ-ТРАНС-РЕТИНАЛЯ С БИСЛОЙНЫМИ ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 499-507

УДК 577.352.2

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛНОСТЬЮ-ТРАНС-РЕТИНАЛЯ С БИСЛОЙНЫМИ ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ

© 2008 г. А. В. Соколов, В. С. Соколов, Т. Б. Фельдман*, М. А. Островский*

Институт физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 31; стр. 5 факс: (495)-952-55-82; leha.sokolov@gmail.com;

*Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва Поступила в редакцию 04.08.2008 г.

Изучено взаимодействие ретиналя с плоскими бислойными липидными мембранами (БЛМ). Введение ретиналя в растворы с двух сторон мембраны, сформированной из дифитаноилфосфатидилхо-лина (DPhPC) либо его смеси с фосфатидилэтаноламином (DPhPC/DPhPE в весовом соотношении 3:5), приводило к изменению проводимости, индуцированной ионфорами - нонактином (увеличение проводимости) или пентахлорфенолом (уменьшение). Увеличение проводимости, индуцированной нонактином, зависело от липидного состава мембраны и было в 2 раза выше в случае смеси DPhPC/DPhPE. Изменение проводимости при использовании ионофоров разного знака было различным по направлению, что указывает на влияние ретиналя на дипольный потенциал при его проникновении в БЛМ. Разность граничных потенциалов, измеренная методом компенсации внутримембран-ного поля (КВП) после накопления ретиналя в мембране, не превышала 2.5 мВ, что может быть обусловлено его симметричным распределением в бислое. При освещении ретиналь вызывал уменьшение времени жизни мембран, сформированных из ненасыщенных липидов, и инактивацию встроенных в БЛМ грамицидиновых каналов, которая полностью ингибировалась тушителем син-глетного кислорода (азид натрия). Сделан вывод о том, что аккумулированный в БЛМ ретиналь оказывает фотодеструктивное воздействие как на мембранные белки, так и на липидную компоненту мембран, окисляя ненасыщенные липиды, причем этот процесс в значительной степени обусловлен синглетным кислородом.

В ходе фотолиза зрительного пигмента родопсина, а именно на его последней стадии, происходит высвобождение полностъю-транс-ретиналя (далее - ретиналь) из белковой части молекулы -опсина. Затем он восстанавливается с помощью ретинолдегидрогеназы до ретинола, который переносится из наружного сегмента зрительной клетки в клетку ретинального пигментного эпителия. Кроме того, молекулы ретиналя могут переноситься через фоторецепторную мембрану с помощью АТР-зависимого белка-переносчика (АБСЯ) [1]. Однако в патологических ситуациях, например при некоторых формах дегенеративных заболеваний сетчатки, механизм удаления ретиналя из фоторецепторной мембраны нарушается, и он может накапливаться в липидном бислое фоторецепторной мембраны. В таком случае ретиналь связывается с одним из ее фосфолипидов - фосфатидилэтаноламином, образуя сначала ретинилиде-нэтаноламин, а затем - бисретинилиденэтанол-амин (А2Е) [2, 3].

А2Е является основным флуорофором, входящим наряду с другими побочными ретинальсодер-жащими продуктами в состав липофусциновых гранул, накапливающихся в клетках ретинального пигментного эпителия (рис. 1) [1, 4]. Известно, что

при освещении липофусциновых гранул видимым светом происходит генерация свободных радикалов и активных форм кислорода [5, 6]. Помимо этого даже в темновых условиях А2Е способен вызывать разрушение искусственных мембран [7]. Ранее мы исследовали повреждающее воздействие А2Е на бислойные липидные мембраны (БЛМ) [8, 9]. Нами было показано проникновение молекул А2Е в БЛМ и вызванное ими в темноте и при освещении уменьшение времени жизни мембран (так называемый детергентный эффект). Помимо деструктивного воздействия А2Е на БЛМ, в этих работах было показано фотоиндуцированное разрушение встроенного в мембрану грамицидина, которое в некоторой степени моделирует разрушение мембранных белков [10, 11]. При освещении мембраны, содержащей грамицидин, видимым светом в присутствии А2Е наблюдалось уменьшение ее проводимости, которое свидетельствовало о фоторазрушении встроенных в бислой грамицидиновых каналов. Естественно предположить, что аналогичные процессы разрушения могут происходить с ли-пидами и белками фоторецепторных мембран, вызванные присутствием не только А2Е, но и других ретинальсодержащих продуктов, в том числе и самого ретиналя.

499

7*

H3C CH3 CH3 CH

CHO

CH3

Пoлнocmью-mpaнc-peтинaль

O

rAO O

HO-P-O

II

O

no^^ocm^-ю mpanc-peтиналь

^NH2

O

Ri O

Фocфaтидилэтaнoлaмин

O

HO-P-O ¡i

O

N-peтинилидeнфocфaтидилэтaнoлaмин

Биcpeтинилидeнфocфaтидилэтaнoлaмин

A2E

Рис. 1. Cтpyктypнaя фс^мум noлнocmью-mpaнc-peтинaля и пocлeдoвaтeльнocть peaкций, пpивoдящaя к oбpaзoвaнию молекулы A2E из двух молвил peтинaля и одной молекулы фocфaтидилэтaнoлaминa, coглacнo paбoтe [1].

KaR нeдaвнo было пoкaзaнo, noлнocmью-mpaнc-peтинaль, кoвaлeнтнo cвязaнный в фoтopeцeптop-ной мeмбpaнe c дocтyпными ему aминoгpyппaми лизиновых ocтaткoв oпcинa (raR нaзывaeмый A2-poдoпcин) и фocфaтидилэтaнoлaминa, выcтyпaeт в кaчecтвa фoтoceнcибилизaтopa, cпocoбнoгo пpи дейетвии cвeтa нapyшaть вaжнoe нaтивнoe cвoйcтвo poдoпcинa - его cпocoбнocть к peгeнepaции [12]. Это позволяет пpeдпoлoжить, что peтинaль не только является пpeдшecтвeнникoм A2E, но и caм по ce6e cпocoбeн oкaзывaть дecтpyктивнoe воздей-cтвиe та биoлoгичecкиe мeмбpaны, пpoникaя в ли-пидный биcлoй. Для пpoвepки этого пpeдпoлoжe-

ния, кaк и в cлyчae A2E, может быть иcпoльзoвaнa модель - биcлoйнaя липиднaя мeмбpaнa, a тaкжe гpaмицидинoвый кaнaл так aнaлoг вcтpoeннoгo в мeмбpaнy пoлипeптидa.

Целью дaннoй paбoты явилocь изучение по-cлeдcтвий пpoникнoвeния noлнocmью-mpaнc-pe-тинaля в БЛМ. В чacтнocти, мы пoпытaлиcь Bbiflc-нить, зaвиcят ли пpoцeccы вcтpaивaния peтинaля и нapyшeния cтaбильнocти биcлoя от липидного co-cтaвa мeмбpaны в темновых устовиях и пpи ocbâ-щении. Aнaлoгичнo пpoвeдeннoмy нaми paнee то-cлeдoвaнию дeйcтвия A2E, мы изучили влияние aккyмyлиpoвaннoгo в БЛМ peтинaля та фотодита-

мическое разрушение мембран, содержащих ненасыщенные липиды, а также на фотоинактивацию грамицидинового канала.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовались БЛМ, полученные по методике Мюллера - Рудина в ячейке из инертного гидрофобного материала (тефлон), разделенной перегородкой на две равные по объему (750 мкл) камеры, заполненные буферным раствором. Бислойная мембрана формировалась на круглом отверстии в центре перегородки диаметром 0.8 мм. Для измерения емкости и проводимости мембраны к электроду с одной стороны мембраны подключали генератор переменного пилообразного напряжения (выход ЦАП платы L780, Lcard, Россия), а с другой - усилитель тока Keithley-427 (США), выход которого был связан со входом АЦП той же платы. Значения емкости и проводимости вычислялись с помощью программы, разработанной авторами. Емкость БЛМ рассчитывалась как отношение амплитуды скачка тока к скорости изменения приложенного к мембране потенциала, проводимость -как наклон вольт-амперной характеристики в точке нулевого напряжения. О том, что удалось сформировать бислойную мембрану, свидетельствовало появление емкости 1-3 нФ. Все электрические измерения проводили с помощью хлорсеребряных электродов, которые контактировали с растворами в ячейке через солевые мостики, изготовленные из наконечников для микропипеток. Нижнюю часть наконечника заполняли агаром, приготовленным с 0.1 М KCl, а сверху наливали водный раствор 0.1 М KCl, в который погружали электрод. Сопротивление электродов с мостиками составляло не более 40-50 кОм.

Растворы готовили на дважды дистиллированной воде из KCl (х.ч. "Реахим", Россия) и HEPES ("Calbiochem", США). В работе использовали буфер следующего состава: 10 мМ KCl, 1 мМ HEPES, pH 7.5. Для подведения pH использовали KOH (х.ч., "Реахим"). Для формирования БЛМ использовали растворы дифитаноилфосфатидилхолина (DPhPC, 15 мг/мл), диолеоилфосфатидилхолина (DOPC, 40 мг/мл) ("Avanti Polar lipids", США), дифитаноил-фосфатидилэтаноламина (DPhPE) ("Avanti Polar lipids") и смеси DPhPC с DPhPE (в массовом соотношении 3:5, общая концентрация 40 мг/мл) в декане. Спиртовой раствор ретиналя (5 мМ) добавляли в ячейку после формирования БЛМ в количестве 510 мкл. Концентрация ретиналя в ячейке составляла 50-80 мкМ, Присутствие в ячейке спирта (не более 2%) не оказывало влияния на стабильность БЛМ. Проникновение ретиналя в БЛМ регистрировали двумя способами: по изменению либо про-

водимости бислоя в присутствии ионофоров, либо разности граничных потенциалов методом компенсации внутримембранного поля (КВП). В первом случае проводимость БЛМ индуцировалась нонактином (N), который является переносчиком катионов, или пентахлорфенолом (PCP), переносящим анионы. В этих опытах ионофоры, как и ретиналь, добавлялись симметрично в оба отсека ячейки. Концентрации нонактина и пен-тахлорфенола в водном растворе составляли по 50 мкМ.

Метод КВП основан на способности мембран сжиматься в электрическом поле, тем самым увеличивая свою емкость [13-15]. Значение емкости минимально, когда электрическое поле внутри мембраны равно нулю, а напряжение, при котором оно достигается, равно разности граничных потенциалов БЛМ. Это напряжение измерялось с помощью автоматической установки, которая определяла точку минимума емкости как постоянную составляющую приложенного к мембране синусоидального напряжения, при котором вторая гармоника емкостного тока обращается в нуль. Экспериментальная установка для измерений методом КВП была идентична используемой в предыдущих работах [8, 9].

В опытах по наблюдению фотоэффектов, в том числе при инактивации грамицидина, использовали ячейку с окошком, позволяющим освещать мембрану. Для освещения использовалась ртутная лампа мощностью 250 Вт. Ее свет проходил через водный тепловой фильтр и стеклянный светофильтр СЗС-20, ограничивающий спектр синей областью (ниже 550 нм). С помощью линзы свет фокусировали на отверстии тефлоновой ячейки. Интенсивность освещения БЛМ, измеренная с помощью калориметра РТН-31С, составляла 340 Вт/м2. При измерениях методом КВП, а также при изучении фотоэффектов и фотоинактивации, ретиналь добавлялся в ячейку только со стороны, противоположной от источника света (цмс-о

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком