научная статья по теме ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННОГО АНАЛОГА УБИХИНОНА (MITOQ10) С ДТ-ДИАФОРАЗОЙ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННОГО АНАЛОГА УБИХИНОНА (MITOQ10) С ДТ-ДИАФОРАЗОЙ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 1, с. 34-40

УДК 577.23

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННОГО АНАЛОГА УБИХИНОНА (MitoQ10) С ДТ-ДИАФОРАЗОЙ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ

© 2008 г. |В. И. Каргин|, К. Ä. Мотовилов, М. Ю. Высоких, Л. С. Ягужинский

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495) 939-0338;

электронная почта: yag@genebee.msu.su Поступила в редакцию 15.08.2007 г.

Изучено влияние MitoQ10 - аналога коэнзима Q, содержащего положительно заряженную децилтет-рафенилфосфониевую группировку (MitoQ10), на функции фосфорилирующих митохондрий печени. Методом ингибиторного анализа показано, что при добавлении в микромолярной концентрации этот хинон может восстанавливаться NADH-зависимой ДТ-диафоразой. При этом в условиях окисления малата хинон индуцирует перенос электронов от NADH на кислород, шунтируя блок электронного транспорта, который возникает в комплексе I при добавлении ротенона. Возникающее в присутствии ротенона и MitoQ10 (1 мкМ) стационарное дыхание митохондрий так же, как КЗ-шунт, блокируется дикумаролом - ингибитором ДТ-диафоразы, миксотиазолом - ингибитором комплекса III и цианидом - ингибитором цитохромоксидазы. Таким образом, в присутствии ротенона MitoQ10 индуцирует в митохондриях следующую цепь электронного транспорта: NADH —«- ДТ-диафораза —»-—► MitoQ10 —» комплекс III —► комплекс IV —- O2. Показано также, что в условиях окисления малата (но не сукцината) MitoQ10, как и высокие концентрации витамина К3, может индуцировать цианид-резистентное дыхание и открывание неспецифической поры в митохондриях и тем самым блокировать процесс окислительного фосфорилирования. На основании полученных данных сделан вывод, что MitoQ10 правильнее рассматривать не как аналог природного CoQ10, а как аналог гидрофильных хинонов (витамина К3, дурохинона и др.), хорошо известных как субстраты митохондриальной ДТ-диафоразы, с которой CoQ10 не взаимодействует.

В системе окислительного фосфорилирования митохондрий коэнзим 0 (Со010) играет важную роль, он принимает непосредственное участие в работе системы электронного транспорта и системы сопряжения дыхания и фосфорилирования [1]. Изучению свойств аналогов Со010, как кофакторов системы фосфорилирования, посвящено большое количество работ (см. обзор [2]), в том числе направленных на выяснение связи между химическим строением этих соединений и их функцией в мито-хондриях. Сравнительно недавно в лаборатории Мёрфи [3] была синтезирована серия аналогов Со010 (Мко0) нового типа, содержащих положительно заряженную трифенилфосфониевую группировку. Эти производные - МИоО - имеют две особенности: способность накапливаться в мито-хондриальном матриксе за счет энергии электрического потенциала на внутренней мембране митохондрий и (в восстановленной форме) служить ловушкой свободных радикалов. Многие частные окислительно-восстановительные реакции этих соединений и их транспорт в митохондриях систе-

матически изучены [4]. Оказалось, что некоторые хиноны этого ряда способны эффективно восстанавливаться комплексом II дыхательной цепи, но соответствующие им гидрохиноны практически не окисляются очищенным комплексом III [5, 6]. Показано, что МИо010 не восстанавливает дыхания дрожжей, дефицитных по Со010 [5, 6]. В то же время влияние положительно заряженных фосфоние-вых производных Со010 на функционирование фосфорилирующих митохондрий систематически не изучалось [4].

O

H3C H3C

Сокращения: MitoQ - митохинон, С^ТРР - трифенил-додецилфосфоний, БСА - бычий сывороточный альбумин, FCCP - трифторметилфенилгидразонкарбонилцианид, АФК -активные формы кислорода.

MitoQ

В частности, открытым остался крайне важный вопрос о том, может ли новое производное Со010 -МИо010 - поддерживать стационарную работу электрон-транспортной цепи в интактных митохондриях. Данные [5, 6] дают отрицательный ответ на этот вопрос: МИо010 не может полностью

выполнять функцию CoQ10 в системах, дефицитных по этому соединению. Однако ответ на вопрос о возможности совместного участия CoQ10 и его синтетического аналога в парциальных окислительно-восстановительных реакциях, протекающих в комплексе III интактных митохондрий, обсуждается [7]. Весьма вероятно, что в наших опытах реализуется именно эта ситуация.

Из теоретических соображений представлялось важным ответить на вопросы: может ли в условиях работы цикла Кребса положительно заряженный аналог CoQ10 (I) принимать участие в работе системы транспорта электронов в митохондриях и влияет ли MitoQ10 на процесс окислительного фосфорилирования.

Более конкретная цель настоящей работы состояла в том, чтобы найти условия, при которых MitoQ10 индуцирует стационарное дыхание в интактных митохондриях, показать тем самым его способность вступать в обратимые окислительно-восстановительные реакции в митохондриях.

Эту задачу удалось решить благодаря тому, что в митохондриях печени нами был обнаружен не описанный ранее путь восстановления этого хино-на NADH-зависимой митохондриальной ДТ-диа-форазой. В условиях окисления малата нам удалось наблюдать стационарное дыхание митохондрий в присутствии ротенона, которое индуцировалось добавлением MitoQ10 и подавлялось ингибитором ДТ-диафоразы - дикумаролом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Митохондрии печени крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования из печени беспородных белых крыс по стандартной методике [8]. Опыты проводили в изотонических условиях. Среда выделения содержала 210 мМ маннитола, 40 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES-трис (рН 7.4), 0.5 мМ EDTA, 0.5 мг/мл БСА. Митохондрии дважды промывали раствором, содержащим 210 мМ маннитола, 40 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES-трис, чтобы удалить EDTA и БСА из среды выделения. Полученную суспензию митохондрий хранили во льду. Концентрацию белка измеряли биуретовым методом [9].

Скорость дыхания митохондрий измеряли полярографическим методом с помощью кислородного электрода Кларка на полярографе Oxygraph Cyclobios Ар PAAR (Австрия). Среда инкубации содержала 110 мМ КС1, 20 мМ КН2РО4, 10 мМ HEPES-трис. Величину коэффициента ADP/O определяли из полярографической кривой по методу Чанса.

Использованные реактивы: КС1, КН2РО4, ("Helicon", Россия); EGTA ("Applichem", Германия); HC1, (ЗАО "Каустик", Россия); БСА, роте-нон, миксотиазол, дикумарол, FCCP, циклоспорин,

сукцинат, HEPES, трис ("Sigma", США); ADP ("Cal-biochem", Германия); сахароза ("Merck", США). MitoQ10 синтезирован согласно [10]. Для идентификации и характеристики новых путей транспорта электронов, возникающих в митохондриях в присутствии MitoQ10, использован метод ингиби-торного анализа. Концентрация MitoQ10 в стоковом растворе не превышала 10-4 М. В полярографической ячейке концентрация этого хинона не превышала 0.5-1 мкМ, поскольку в более высоких концентрациях это соединение, очевидно, образует мицеллы. Концентрации ингибиторов в опытах составляли: ротенона 0.25-0.5 мкМ, ма-лоната 2 мМ, миксотиазола 0.5 мкМ, цианида 1 мМ. Концентрация FCCP - 0.2-0.3 мкМ, ADP -500 мкМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе исследовано действие микромолярных концентраций МИо010 на дыхание митохондрий в средах, не содержащих комплексонов Са2+ -ЕБТА и ЕвТА, блокирующих открывание неспецифической поры в мембране митохондрий. Нами обнаружено, что в условиях окисления малата МИо010 стимулирует дыхание, подавленное роте-ноном. Этот вывод сделан на основании данных, приведенных на рис. 1, из которых видно, что скорость дыхания митохондрий печени (в состоянии 3 по Чансу) в присутствии МИо010 гораздо выше (рис. 1а), чем в контрольной пробе (рис. 16).

Благодаря наличию децилтрифенилфосфоние-вой группировки МИоО обладает высокими поверхностно-активными свойствами. Контрольный эксперимент с добавкой раствора додецилтрифе-нилфосфония (рис. 16) показал, что детергент, в структуре которого отсутствует ядро хинона, не оказывает влияния на митохондрии. Следовательно, наблюдаемый эффект активации под действием МИо010 подавленного ротеноном дыхания (рис. 1а,б) не связан с поверхностно-активными свойствами этого хинона.

С целью выяснения природы обнаруженного эффекта проведен ингибиторный анализ (рис. 1а-в), который показал, что ингибитор митохондриальной ДТ-диафоразы - дикумарол, в присутствии МИо010 вдвое снижает скорость нечувствительного к ротенону дыхания митохондрий, но совершенно не влияет на дыхание в контрольной пробе, не содержащей МИо010 (рис. 1а,б).

Из результатов этого эксперимента следует, что МИо010 эффективно восстанавливается КАБН-зависимой ДТ-диафоразой митохондрий, благодаря чему образуется шунт переноса электронов от КАБН на кислород в обход сайта связывания ротенона - "Мйо010-шунт" (см. схему).Повтор-ные добавки ротенона не снижают скорости нечувствительного к ротенону дыхания митохондрий,

циклоспорин

Рис. 1. Индукция "МкоОю-шунта" с участием ДТ-диафоразы митохондрий печени (а, •). Подавление ингибитором ДТ-диафоразы - дикумаролом дыхания митохондрий в присутствии ротенона: опыт в присутствии МИоОю (а); контроль в присутствии С^ТРР (•); эффект воздействия повторных добавок ротенона на дыхание митохондрий в присутствии 1 мкМ МкоО (в). Цифры на полярограммах соответствуют скоростям дыхания митохондрий в мкМ О/мг белка/мин.

возникающего в присутствии Мко010 (рис. 1в). Это позволяет говорить о том, что в условиях опыта действительно происходит образование шунта, и исключает предположение о конкурентном вытеснении ротенона из центра специфического связывания положительно заряженным хиноном. Следует указать, что подобный шунт давно описан для электронейтральных полярных хинонов, в частности, витамина КЗ [11].

Как можно видеть из рис. 16, дикумарол только на ~50% подавляет дыхание, индуцированное добавлением MitoQ10. Оставшееся дыхание чувствительно к действию цианида, который, как следует из рис. 1а, тоже не полностью подавляет дыхание. В отдельном эксперименте показано, что дыхание, не связанное с функционированием ДТ-диафоразы, частично подавляется конкурентным ингибитором

ДТ-диафораза А

Li

2е-

2H+

"M" MitoQH2

MitoQ N

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком