ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 4, с. 522-528
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ САЛИЦИЛАТ- И ЖАСМОНАТ-ИНДУЦИРУЕМЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ В РАЗВИТИИ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ К ФИТОФТОРОЗУ С УЧАСТИЕМ ГЕНА ПЕРОКСИДАЗЫ М21334 © 2014 г. А. В. Сорокань, Г. Ф. Бурханова, И. В. Максимов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа Поступила в редакцию 02.08.2013 г.
Изучали влияние 50 мкМ салициловой (СК) и 0.1 мкМ жасмоновой (ЖАК) кислот на активность транскрипции генов, кодирующих изопероксидазу (М2133) и белки PR-1 и PR-6 (PR-1, PR-6), при формировании у растений картофеля (Solanum tuberosum L.) защитной реакции против Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Значительное накопление транскриптов гена пероксидазы М21334 происходило в инфицированных растениях, обработанных ЖАК или одновременно СК и ЖАК, или при последовательной обработке ЖАК после СК, но не СК после ЖАК. Уменьшение площади развития симптомов фитофтороза на обработанных этими соединениями листьях картофеля является одним из показателей их иммуностимулирующего действия. Полученные данные указывают на то, что устойчивость растений картофеля к фитофторозу регулируется через системную индуцированную устойчивость, где важное место в качестве посредника занимает ЖАК, но при условии активного регуляторного участия СК.
Ключевые слова: Solanum tuberosum - Phytophthora infestans - жасмоновая кислота - салициловая кислота - пероксидаза - PR-белки
DOI: 10.7868/S0015330314040198
ВВЕДЕНИЕ
Растения находятся под постоянным прессом патогенов, реализующих различные типы стратегий питания. Некротрофы получают питательные вещества из уже убитых ими клеток хозяина, а биотрофы, длительно присутствуя в тканях, подавляют их иммунные реакции и используют ресурсы живых клеток, ослабляя растения. Выделяется также группа гемибиотрофов, в жизненной стратегии которых сочетаются свойства и биотро-фов, и некротрофов. Соответственно в зависимости от трофности патогена в растениях активируются защитные механизмы, зачастую кардинально различающиеся между собой. Природа их регуляции широко обсуждается и известно, что важными сигнальными соединениями являются салициловая (СК) и жасмоновая (ЖАК) кислоты, индуцирующие, соответственно, системную приобретенную устойчивость (СПУ) к биотрофам [ 1, 2]
Сокращения: ЖАК — жасмоновая кислота; СК — салициловая кислота; СИУ — системная индуцированная устойчивость; СПУ — системная приобретенная устойчивость. Адрес для корреспонденции: Максимов Игорь Владимирович. 450054 Уфа, пр. Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Электронная почта: maksimov@ufaras.ru
и системную индуцированную устойчивость (СИУ) к фитофагам (насекомым) и некротроф-ным патогенам [3].
В различных источниках содержатся указания на факты формирования устойчивости картофеля к фитофторозу под влиянием как СК, так и ЖАК [4, 5]. Еще в начале 80-х годов прошлого века впервые было установлено участие СК в СПУ, где важным маркером следует считать экспрессию гена, кодирующего белок PR-1 [1]. Среди генов пероксидаз III класса также есть изогены, высокочувствительные к СК [6].
Другая сигнальная молекула - ЖАК - участвует в запуске СИУ посредством активации транскрипции генов ферментов фенольного метаболизма, в том числе ряда изопероксидаз [7] и ингибиторов протеиназ (например, PDF1.2 и PR-6). В качестве примера можно привести активацию под влиянием ЖАК двух нечувствительных к СК изоге-нов пероксидаз у растений Stylosanthes humilis [8].
Между тем в литературе отмечается, что сигналы, индуцирующие СПУ и СИУ, строго индивидуальны и часто накладываются друг на друга, что приводит при совместном применении СК и ЖАК к многократному снижению устойчивости растений к патогенам по сравнению с варианта-
ми, в которых СК и ЖАК применяются по отдельности [9, 10]. Обнаружено, что если обработка ЖАК многократно активировала пероксидазу в листьях арабидопсиса дикого типа, то в мутантах cep1, с конститутивно повышенной продукцией СК, этого не наблюдалось [11]. Вместе с тем известны и данные об отсутствии взаимного влияния или даже о наличии определенного синергизма или аддитивного эффекта в действии сигнальных соединений, индуцирующих СПУ и СИУ [12, 13].
Разнообразие ответной реакции генов перок-сидазы в растениях при формировании СПУ или СИУ, вероятно, связано с широким спектром их молекулярных форм. Это вынуждает исследователей идентифицировать физиологические функции отдельных изоформ этого фермента [7, 14], поскольку пероксидазы часто упоминаются в качестве ключевых факторов, определяющих развитие устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды и, в частности, к патогенам [15, 16].
Исходя из этого, целью данной работы являлось определение влияния сигнальных молекул (СК и ЖАК), использованных в разных сочетаниях, на активность транскрипции в растениях картофеля чувствительного к поранению гена, кодирующего изопероксидазу (М21334) [17], а также генов маркерных белков СПУ (PR-1) или СИУ (PR-6) в условиях инфицирования растений возбудителем фитофтороза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В работе были использованы пробирочные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) восприимчивого к фи-тофторозу сорта Ранняя роза, культивируемые на агаризованной среде МС [18] в течение 30 суток при 16-часовом освещении (4 клк), дневной температуре 26°С и ночной 20°С. Среда содержала 50 мкМ СК или 0.1 мкМ ЖАК, или смесь 50 мкМ СК + 0.1 мкМ ЖАК. За сутки до инокуляции суспензией зооспор Phytophthora infestans (Mont.) de Bary часть 30-суточных растений, выращенных на СК, дополнительно обрабатывали путем опрыскивания 0.1 мкМ ЖАК (вариант "ЖАК после СК"), а выращенных на ЖАК — 50 мкМ СК (вариант "СК после ЖАК").
Культура оомицета P. infestans (штамм 1.2) была любезно предоставлена проф. Ю.Т Дьяковым из коллекции биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Перед началом опыта проводили восстановление агрессивности патогена путем его реи-нокуляции на стерильных микроклубнях картофеля, полученных в пробирочной культуре. На вторые сутки после инокуляции пораженную ткань пересаживали на агаризованную среду и
выращивали в течение 7 суток. Для получения зооспор поверхность 7-суточной культуры P. infestans в чашке Петри заливали 10 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживали 30 мин при 4°С, затем 30 мин при комнатной температуре. Зооспоры подсчитывали в камере Фукса-Ро-зенталя.
Инокуляция растений и оценка симптомов болезни. Часть растений после 30 суток культивирования инфицировали путем нанесения на каждый лист 5 мкл суспензии зооспор (105 спор/мл) или дистиллированной воды (в вариантах без заражения). Визуальные симптомы болезни наблюдали в течение 7 суток, и степень их развития оценивали по 5-балльной шкале. Отсутствие симптомов соответствовало 0 баллов, поражение от 1 до 25% площади листа — 1 баллу, поражение от 26 до 50% — 2 баллам; поражение от 51 до 75% — 3 баллам и поражение более 75% — 4 баллам.
Выделение общей РНК проводили с использованием тризола, согласно протоколу фирмы-поставщика ("Molecular Research Center, Inc.", США), из побегов картофеля, зафиксированных в жидком азоте через 6, 24 и 48 ч после инокуляции. Концентрации всех образцов выравнивали; измерения оптической плотности РНК в образцах проводили на спектрофотометре BioSpecmini DNA-RNA-Protein Analyzer ("Shimadzu", Япония). Реакцию обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) проводили в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 10 мкг общей РНК, 1 мкл M-MLV обратной транскриптазы ("Fermentas", Литва),
9 мкл 1х буфера M-MLV для обратной транскрипции, для обратной транскрипции, 32 мМ MgCl2, 1 мкл олигонуклеотидных праймеров, по 5 мкл 1.25 мМ dNTP. Отжиг праймеров на матрице РНК проводили в течение 5 мин при 65°С, а построение кДНК - по матрице РНК в течение 1 ч при 37°С. Полученную кДНК использовали в реакции амплификации. ПЦР проводили в амплифи-каторе типа ТП4-ПЦР-01-Терцик ("ДНК-Технология", Россия) с использованием праймеров к последовательностям генов М21334, PR-1 и PR-6 картофеля (табл. 1). Для нормирования результатов экспрессии генов использовали праймеры против гена "домашнего хозяйства", кодирующего актин [21].
Электрофорез для разделения ПЦР-продуктов
проводили в 7% полиакриламидном геле в элек-трофоретической камере Mini-Protean II Electro-phoretic Ct-II ("Bio-Rad", США). Для визуализации ДНК после электрофореза гель в течение
10 мин инкубировали в растворе бромистого эти-дия (0.5 мкг/мл), просматривали в трансиллюминаторе Gel Doc XR ("Bio-Rad") и фотодокумен-тировали с использованием Gel Camera System. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы LabWorks 4.6 и TotalLab,
Таблица 1. Праймеры к последовательностям исследованных генов, использованные в ПЦР
Номер последовательности в Генбанке Продукт активности гена Праймеры Источник
М21334 пероксидаза F: 5'-ttcgacaacaagtactacttcga-3' R: 5'-cggatctctcccgcgctgc-3' [17]
AY050221 PR-1 белок F: 5'-tgggtggtggttcatttcttgt-3' R: 5'-catttaattccttacacatcataag-3' [19]
SGN-U313509 PR-6 белок F: 5'-gggaaagaatatgctcaagttat-3' R: 5'-aattctccatcatcttccactg-3' [20]
X55749.1 актин F: 5'-gatggtgtcagccacac-3' R: 5'-attccagcagcttccattcc-3' [21]
v. 2.01 ("UVP, Inc.", США). Для определения размеров ампликонов использовали маркерные ДНК GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder ("Fermentas"). Данные активности транскрипции изученных генов нормализованы против активности транскрипции гена актина [21] и представлены в условных единицах.
Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей генов пероксидазы проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы "DNASTAR, Inc." (США).
Статистика. Все опыты проводили в 3 биологических и 3 аналитических повторностях. При обработке результатов использовали компьютерные программы фирмы "Stat Soft" (Statistica 6.0). В табл. 2 и на рисунке приведены средние значения биологических повторов и их стандартные отклонения.
жала степень развития фитофтороза, о чем свидетель
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.