^^^^^^^^^^^^^^ РАДИАЦИОННАЯ
ХИМИЯ
547.752:544.54:543.23
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРИПТОФАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ С КИСЛОРОД- И АЗОТЦЕНТРИРОВАННЫМИ РАДИКАЛАМИ © 2015 г. Р. Л. Свердлов*, А. В. Хрищанович**, С. Д. Бринкевич*, О. И. Шадыро*
*Белорусский государственный университет Беларусь, 220030, Минск, просп. Независимости, 4 E-mail: shadyro@open.by **РУП "Белмедпрепараты" Беларусь, 220007, Минск, ул. Фабрициуса, 30 Поступила в редакцию 01.09.2014 г. В окончательном виде 13.10.2014 г.
Изучено взаимодействие триптофана и его производных с азотцентрированными радикалами 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и кислородцентрированными радикалами, образующимися при радиолизе насыщенного кислородом этанола и его водных растворов. Установлено, что триптофан, 5-гидрокситриптофан, серотонин, гарман, гармин и гармалин, в отличие от пиррола, индола и ме-латонина, способны восстанавливать кислородцентрированные радикалы за счет реакции переноса электронов с неподеленной пары атомов азота. Показано, что серотонин и 5-гидрокситриптофан восстанавливают радикалы 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила за счет реакции переноса атома водорода с гидроксильных групп молекул. При этом пиррол, индол, триптофан, мелатонин, гарман, гармин и гармалин, не содержащие в своей структуре гидроксильной группы фенольного типа, не взаимодействуют с радикалами 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила. Методом хромато-масс-спек-трометрии идентифицированы конечные молекулярные продукты взаимодействия серотонина и 5-гидрокситриптофана с радикалами 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила.
DOI: 10.7868/S0023119315020126
УДК
Активные формы кислорода (АФК) и азота (АФА) участвуют во многих процессах повреждения биомолекул при действии на них различных факторов [1]. Причем АФК и АФА могут образовываться как под воздействием ионизирующих излучений, при метаболизме ксенобиотиков, так и в ходе реализации реакций иммунного ответа и "нормального" обмена веществ [1, 2]. Количество свободных радикалов в организме человека и их природа контролируется так называемой антиок-сидантной системой, простейшим звеном которой являются низкомолекулярные регуляторы гомолитических процессов [1]. Поэтому вещества, способные регулировать направление и интенсивность свободнорадикальных процессов, часто обладают полезными фармакологическими свойствами [3, 4].
В силу высокой реакционной способности время жизни радикальных форм АФК и АФА в организме невелико [5]. Они расходуются в реакциях с биологически важными молекулами, в результате чего образуются менее активные и, соответственно, более долгоживущие радикалы, локализованные в большинстве случаев на атоме углерода. Дальнейшие процессы с участием углеродцентрированных радикалов обусловливают патофизиологическое и
регуляторное действие свободных радикалов в организме человека [1, 2, 6—10].
В работах [11, 12] нами было показано, что ряд "классических антиоксидантов", синтезируемых в организме из триптофана, обладает высокой реакционной способностью по отношению к углеродцентрированным радикалам. Было установлено, что триптофан, 5-гидрокситриптофан, серотонин и в меньшей степени мелатонин способны присоединять а-гидроксиэтильные радикалы (а-ГЭР), предотвращая их дальнейшие превращения, а Р-карболиновые алкалоиды подавляют рекомбинацию а-ГЭР за счет их окисления. В продолжение исследования в настоящей работе изучено взаимодействие триптофана и его производных с кислород- и азотцентрированными радикалами, индуцирующими развитие "окислительного стресса". Установление взаимосвязи между структурой и реакционной способность триптофана и его производных по отношению к углерод-, азот- и кислородцентрированным радикалам может послужить основой для поиска новых эффективных регуляторов свободнорадикальных реакций в организме человека, обладающих радиозащитными свойствами.
Взаимодействие триптофана и его производных с кислородцентрированными радикалами
СООН
СООН
Н -О
Триптофан (III)
Чн
Пиррол (I)
Н
Индол (II)
5-Гидрокситриптофан (IV)
N Н
Гарман (VII)
Серотонин (V)
О
Мелатонин (VI)
N
N
СН3
СН
Н
Гармин (VIII) Н
О
Н
Гармалин (IX)
НО
Н3С
О НО ОН
Н3С
СН3 Тролокс (X)
О =
СН3
СН3 3
а-Токоферол (XI)
НО. НО НО'
О
Н8
СООН
ОН
N^1
Аскорбиновая кислота (XIII)
Цистеин (XIV)
СНз —3
в-Токоферол (XII)
С}
ДФПГ (XV)
Рис. 1. Структурные формулы использованных в работе соединений.
было изучено нами методом стационарного радиолиза насыщенных кислородом этанольных и водно-этанольных растворов. Облучение оксиге-нированных этанольных растворов позволяет генерировать кислородцентрированные радикалы, структурно родственные образующимся в живых организмах. Поэтому подобная модель широко используется нами и другими исследователями для изучения реакционной способности различных классов веществ по отношению к кислородцен-трированным радикалам [13—16].
Изучение реакционной способности и механизма взаимодействия триптофана и его производных с азотцентрированными радикалами было проведено нами методом остановленного потока (Stopped-flow): измерены константы скорости реакции псевдопервого порядка с радикалами 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ). Методом жидкостной хромато-масс-спектро-метрии были идентифицированы конечные молекулярные продукты взаимодействия исследуемых веществ с ДФПГ. Выбор модели обусловлен широким использованием радикалов ДФПГ для
установления антирадикальной активности различных классов низкомолекулярных антиокси-дантов [17—20].
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Без предварительной очистки использовали пиррол (I), индол (II), триптофан (III), 5-гидрок-ситриптофан (IV), серотонин (V), мелатонин (VI), гарман (VII), гармин (VIII), гармалин (IX), тролокс (X), а-токоферол (XI), 8-токоферол (XII), аскорбиновую кислоту (XIII), цистеин (XIV) и 2,2-дифенил-1-пикрилгидразильный радикал (XV) фирмы '^1§та-АЫпск" (рис. 1). Чистота соединений составляла не менее 98%.
Для радиационно-химического эксперимента растворы исследуемых соединений готовили путем растворения их точных навесок в 96 об. % и 1 М этаноле. Для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду и спирт этиловый пищевой марки "Люкс" (96 об. %), который перед использованием очищали перегонкой на ректификационной колонне.
В силу высокой летучести этанола для приготовления оксигенированных растворов тестируемых соединений растворы продували кислородом высокой степени чистоты (99.9%) в мерной посуде в течение 60 мин, после чего объем испарившегося растворителя компенсировали окси-генированным этанолом, растворы перемешивали. Предварительно продутые кислородом ампулы заполняли растворами и запаивали. Концентрация производных триптофана составляла 10-3 моль/л (5 х 10-4 моль/л для триптофана). Растворы исследуемых веществ в 1 М этаноле при рН 7 готовили с использованием фосфатного буфера (0.01 М, KH2PO4 и K2HPO4 • 3H2O). Растворы продували кислородом в ампулах в течение 60 мин, после чего их запаивали. Концентрация производных триптофана составляла 2 х х 10-4 моль/л (2 х 10-5 моль/л для гармана и гар-мина).
Облучение проводили на установке MPX-y-25M с источником 60Co. Мощность поглощенной дозы составляла 0.29 ± 0.008 Гр/с. Интервал поглощенных доз 0.10—0.52 кГр.
Продукт радиационно-химических превращений этанола — ацетальдегид (АА), а также изменение концентрации пиррола, определяли на хроматографе GC-17A фирмы "Shimadzu" по методике [11].
Для определения пероксида водорода использовали реагентоспектрофотометрический метод, основанный на образовании желтого комплекса пероксида водорода с сульфатом титанила в сернокислом растворе [16]. Для измерений использовался спектрофотометр "Specord S600" (Analytik Jena, Германия), так же как и в случае определения концентрации индола.
Определение концентраций триптофана, 5-гид-рокситриптофана, серотонина, мелатонина, гарма-на, гармина, гармалина и идентификация продуктов их радиационно-индуцированных превращений выполнялись на жидкостном хроматографе "Shimadzu" LCMS-2020 с масс-спектрометрическим квадрупольным детектором по методике [12].
Радиационно-химические выходы (G, молекула/100 эВ) образования продуктов реакций и расходования тестируемых соединений рассчитывали на линейных участках зависимости концентраций веществ от поглощенной дозы. Для расчета величин радиационно-химических выходов использовали результаты не менее двух независимых экспериментов. Значение ошибки определения радиаци-онно-химических выходов рассчитывали методом наименьших квадратов с использованием коэффициента доверительной вероятности 0.95.
Для изучения взаимодействия исследуемых веществ с радикалами ДФПГ использовали метод остановленного потока (Stopped-flow). Для этого точные навески исследуемых веществ растворяли
в дважды перегнанном на ректификационной колонне техническом этиловом спирте (96 об. %). Концентрация растворов исследуемых соединений составляла 10—3 моль/л, а концентрация ДФПГ — 10—4 моль/л. Десятикратный избыток исследуемых соединений по отношению к радикалу использовался для создания условий кинетики реакции псевдопервого порядка. Смешивание растворов проводилось в соотношении 1:1 по объему при помощи двухшприцевой установки Pro-K.2000 Rapid kinetics system stopped-flow mixing accessory (Applied photophysics limited, Великобритания). Растворы до смешения термостати -ровали при 25°C в течение 10 мин в установке Pro-K.2000 при помощи внешнего контура циркуляции термостата F12-ED (Julabo, Германия). Изотермический режим проведения реакции (25°C) поддерживали c использованием встроенного в кюветодержатель электротермического элемента Пельтье (Analytik Jena, Германия).
Измерение концентрации ДФПГ в процессе его реакции с исследуемыми веществами осуществлялось на спектрофотометре "Specord S600". Работа оборудования контролировалась компьютером при помощи программы WinASPECT Version 2.3.1.0. Условия анализа: диапазон измеряемых длин волн — 400—800 нм, длительность одного измерения — 90 мс; количество усредняемых спектров, измеряемых в течение 90 мс — 2; количество измерений исследуемых растворов — от 20 до 300; совокупная продолжительность измерений — от 1 до 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.