НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 4, с. 278-282
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.8.05
взаимосвязь bdnf и его проформы с уровнем активной
каспазы-3 в отделах головного мозга неонатальных крыс
© 2012 г. В. В. Музыка1, 2, *, П. Н. Меньшанов1, А. В. Баннова1, Н. Н. Дыгало1, 2
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск 2Новосибирский государственный университет, Новосибирск
Мозговой нейротрофический фактор (mat-BDNF) способствует выживанию нейронов, а его белок-предшественник (pro-BDNF), провоцирует гибель клеток, что потенциально обеспечивает обеим формам нейротрофина хотя и противоположную, но важную роль в формировании мозга. Анализ уровней mat-, pro-BDNF и активной каспазы-3 в отделах головного мозга 8-дневных крысят выявил, что их кора, в которой, судя по уровню активной каспазы-3, интенсивно идет апоптоз, имеет самое низкое из изученных структур значение отношения mat-BDNF к pro-BDNF. Напротив, в стволе головного мозга, в котором у неонатальных крысят процессы пролиферации и элиминации клеток в основном уже завершены, соотношение mat-/pro-BDNF существенно выше, чем в коре. Значения соотношения mat-/pro-BDNF в мозжечке и гиппокампе также подкрепляют на межрегиональном уровне его обратную зависимость относительно уровня активной каспазы-3. Результаты работы свидетельствуют, что обе формы BDNF важны для определения судьбы клеток формирующегося головного мозга.
Ключевые слова: mat-BDNF, pro-BDNF, активная каспаза-3, отделы развивающегося мозга.
ВВЕДЕНИЕ
Мозговой нейротрофический фактор (mat-BDNF), молекулярной массой ~14 Кда, как и другие секретируемые белки образуется из белка-предшественника — pro-BDNF (34 Кда) — путем гидролиза вне- и внутриклеточными протеазами [1]. Нейроны ЦНС секретируют зрелые нейро-трофины и их проформы [1]. mat-BDNF с наибольшим избирательным сродством связывается с тирозинкиназными рецепторами плазматической мембраны TrkB. В то же время, незрелая форма нейротрофина (pro-BDNF) взаимодействует с p75NTR рецептором, имеющим низкое сродство к зрелым нейротрофинам [2], поэтому биологическое действие mat-BDNF и pro-BDNF существенно различается [3]. Pro-BDNF индуцирует апоптоз во многих типах нейронов ЦНС в определенные периоды онтогенеза [4], блокирует рост дендритов и вызывает их деградацию в других условиях; mat-BDNF способствует выживанию нервных клеток, разрастанию дендритных деревьев нейронов и стабилизации установленных синаптических контактов [2].
В ходе онтогенеза взаимосвязанные процессы пролиферации и элиминации клеток путем физиологического апоптоза, являющегося непременным компонентом нормального развития моз-
* Адресат для корреспонденции: 630090 Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 10; тел.: +7(383)363-4958-3311; факс: +7(383)333-12-78; e-mail: vv1988m@gmail.com.
га [5, 6], сопутствуют по времени наиболее активному формированию каждой из его структур. Про-и зрелая формы BDNF экспрессируются в стволе мозга и гиппокампе на качественно различающемся уровне у новорожденных детей [7]. В силу потенциального влияния обеих форм нейротрофина на формирование мозга, цель данной работы — сопоставление соотношения mat-BDNF/pro-BDNF в стволе, мозжечке, гиппокампе и коре мозга 8-дневных крысят с уровнем в этих отделах основного эффектора апоптоза — активной каспазы-3, который напрямую коррелирует с интенсивностью процессов физиологической элиминации клеток.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В опытах использовали 8-дневных крысят, рожденных и вскармливаемых собственными матерями — самками линии Вистар. Условия содержания и использования крыс в опытах соответствовали отечественным и международным нормам гуманного обращения с экспериментальными животными.
Уровни белков mat-BDNF и pro-BDNF определяли в мозжечке, в гиппокампе, во фронтальной коре полушарий и в стволовой части мозга, включавшей мост и продолговатый мозг. Для определения содержания белков образцы ткани гомогенизировали в лизирующем буфере
ВЗАИМОСВЯЗЬ BDNF И ЕГО ПРОФОРМЫ С УРОВНЕМ АКТИВНОЙ КАСПАЗЫ-3
279
(150 mM NaCl, 50 mM трис-HCl (pH 7.4), 1% тритона X-100, 1 mM PMSF и по 1 мкг/мл леупепти-на, пепстатина и апротинина). После центрифугирования (14000 g, 4°С, 15 мин), 50 мкг белка су-пернатанта денатурировали в буфере (50 mM трис-HCl, pH 6.8, 10%-ного глицерина, 100 mM 2-Р-меркаптоэтанола, 1% додецилсульфата натрия, 0.002% бромфенолового синего; 5 мин при 95°С), разделяли электрофорезом (система HELICON, Россия) в 16.5%-ном полиакрила-мидном геле с додецилсульфатом натрия и переносили на 0.45 цм нитроцеллюлозную мембрану (система Trans-Blot, Bio-Rad Laboratories, США).
Белки выявляли на мембране поликлональны-ми кроличьими антителами (Santa Cruz Biotechnology, США): первичными к BDNF (N-20, 1 : 250), каспазе-3 (H-277, 1 : 250) и бета-актину (I-19-R, 1 : 1000), а также вторичными, конъюгированны-ми со щелочной фосфатазой. Использованные антитела выявляли как pro-BDNF (34 Кда), так и зрелый белок BDNF (14 Кда), различия молекулярных масс которых обеспечивает их четкое разделение электрофорезом и селективное индивидуальное определение их количеств; мембраны проявляли 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфатом (BCIP) и нитротетразолием голубым (NBT). Интенсивность окрашивания полос, соответствующих анализируемым белкам, определяли путем сканирования мембран (Chemidoc, Bio-Rad Laboratories, США) и компьютерной денситометрии (программа Scion Image 4.0.3.2 Scion Corporation, США). Условия проведения анализов обеспечивали линейную зависимость интенсивности сигналов отдельного белка от массы общего белка, нанесенного на дорожку гель-электрофореза, что позволяло оценивать количество каждого анализируемого белка. Поскольку интенсивность сигнала денситометрии зависит как от доли анализируемого белка в образце, так и от общего количества белка, нанесенного на дорожку электрофореза, то необходимо нормирование сигнала анализируемого белка на количество белка, доля которого в общем пуле белков образца относительно постоянна, такого как белок домашнего хозяйства актин, который и выявляли в образцах для этой цели.
Межрегиональные различия по экспрессии белков в отделах мозга оценивали однофактор-ным дисперсионным анализом, достоверность различий между группами устанавливали по критерию множественных сравнений Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У 8-дневных крысят уровень mat-BDNF наиболее низок в коре мозга. Содержание зрелого нейротрофина в этом отделе было на грани выявления методом иммуноблота и достоверно ниже,
12 3 4
mat-BDNF ■ Актин ■
2.0
* 1.6
о
ч
£ 1.2 Ь
N О 0.8 B
at
В 0.4
14 КДа 42 КДа
Рис. 1. Уровни та1>ВВКР в отделах головного мозга 8-дневных крысят. а — иммунодетекция белков после разделения гель-электрофорезом; б — количественная оценка уровня та1>ВВКР, (М ± т, усл. ед. = = условные единицы денситометрии относительно актина). 1 — мозжечок, 2 — стволовая часть мозга, 3 — гиппокамп, 4 — кора больших полушарий. * — р < 0.05 по сравнению с другими отделами мозга.
чем во всех остальных исследованных структурах мозга. Наибольшее содержание та^ВЭМР наблюдалось в стволовой части мозга. Оно было почти в 2 раза выше, чем в гиппокампе, и более чем в 2 выше, чем в мозжечке. Межрегиональные различия по уровню та^ВЭМР были высокодостоверны (рис. 1; F(3¡ 22) = 11.94, р = 0.00008). Уровень рго-ВЭМР в коре мозга был также достоверно (более чем в 2 раза) ниже относительно уровня в стволе мозга и гиппокампе (рис. 2; F(3¡ 20) = 3.15, р = 0.048). Отношение уровней та^ВЭМР к рго-ВОМБ в коре мозга в силу крайне низкого содержания зрелого ВОМБ также было значительно более низким, чем в остальных исследованных структурах (рис. 4; /(3, 21) = 3.68, р = 0.028).
Распределение активной каспазы-3 по отделам мозга неонатальных крысят согласуется с описанными ранее [8]. Уровни этой протеазы апоптоза в коре мозга и гиппокампе достоверно выше, чем в стволовой части мозга и мозжечке (рис. 3, 4; 11) = 33.89,р < 0.001). Между распределением уровня активной каспазы-3 в отделах мозга и отношением та1-ВВМР/рго-ВВМР наблюдается обратная зависимость. Следует отметить, что между содержанием активной каспазы-3 и каждой из форм ВОМБ подобной зависимости не наблюдалось.
а
*
*
2 3 4
pro-BDNF ■ Актин ■
0.8
5 0-6
^
ь
£ 0.4
О «
л
0.2
34 КДа 42 КДа
Каспаза-3
Актин
0.05 д.
о
5 0.04
3
£0.03 а п с
0.02
«
а
§ 0.01 т
2 3 4
17 КДа 12 КДа
42 КДа
а
а
б
*
*
*
Рис. 2. Уровни pro-BDNF в отделах головного мозга 8-дневных крысят. а — иммунодетекция белков после разделения гель-электрофорезом; б — количественная оценка уровня pro-BDNF (М ± т, усл. ед. = = условные единицы денситометрии относительно актина). 1 — мозжечок, 2 — стволовая часть мозга, 3 — гиппокамп, 4 — кора больших полушарий. * — р < 0.05 по сравнению с гиппокампом и стволовой частью мозга.
Рис. 3. Уровни активной каспазы-3 в отделах головного мозга 8-дневных крысят. а — иммунодетекция белков после разделения гель-электрофорезом; б — количественная оценка уровня активной каспазы-3 (М ± т, усл. ед. = условные единицы денситометрии относительно актина). 1 — мозжечок, 2 — стволовая часть мозга, 3 — гиппокамп, 4 — кора больших полушарий. * — р < 0.05 по сравнению с гиппокампом и корой головного мозга.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Соотношение зрелой и про- форм BDNF в отделах мозга неонатальных крысят, впервые описанное в работе, демонстрирует обратную зависимость относительно уровня активной каспазы-3 в этих отделах. Различия структур мозга неонатальных крысят по уровню форм нейротрофина и кас-пазы-3 может быть связано с их неодинаковой степенью зрелости и сформированности к моменту исследования [5].
Полученные в работе межрегиональные различия по уровню нейротрофина согласуются со сведениями об уровнях мРНК BDNF [9, 10, 11] и его концентрации [11, 12, 13] в структурах неона-тального мозга. В дополнение к этим данным обнаружено, что не столько сами по себе уровни mat-BDNF и pro-BDNF, как их соотношение является важным фактором, определяющим склонность клеток к вступлению в апоптоз в ходе онтогенеза.
В соответствие с нейротрофической теорией развития мозга нейроны, избыточно закладывающиеся в раннем онтогенез
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.