РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013, том 7(16), № 1, с. 55-62
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЗАИМОСВЯЗЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ И ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ С НАСТУПЛЕНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИИ ЭКО У ЖЕНЩИН
С БЕСПЛОДИЕМ
© 2013 г. Н.Ю. Сотникова, В.П. Чернышов*, Ю.С. Анциферова, Б.В. Донской*, Л.Е. Туманова*, Л.В. Посисеева, И.В. Речистова
Лаборатория клинической иммунологии, ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Иваново, Россия; * Государственное учреждение «Институт педиатрии, акушерства и гинекологии НАМН Украины», Киев, Украина
Поступила: 21.01.2013. Принята: 04.02.2013
Целью работы было выявить особенности популяционного состава и функциональной активности лимфоцитов и фагоцитов периферической крови и фолликулярной жидкости у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в зависимости от наступления у них беременности после проведения ЭКО для определения возможности использования иммунологических показателей в качестве критериев прогноза успеха ЭКО. Было обследовано 95 женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, участвующих в программе ЭКО. Впоследствии наступление беременности было отмечено у 47 женщин, у 48 пациенток с бесплодием проведение ЭКО оказалось неэффективным. Материалом для исследования служили образцы периферической крови и фолликулярной жидкости, полученные в момент забора яйцеклеток. Определяли фенотип периферических и фолликулярных лимфоцитов и моноцитов/макрофагов, а также цитотоксическую активность периферических ЕК методом проточной цитометрии. Установлено, что в периферической крови женщин с успешным наступлением беременности после ЭКО отмечалось более низкое содержание СЭ3-С056+, С020 + С05 + лимфоцитов, сниженные значения индекса цитотоксичности и более высокое содержание ИЬЛ-ОЯ + и СШ1Ь+ моноцитов. В фолликулярной жидкости у этих женщин выявлено сниженное количество СО3-СШ6+ лимфоцитов и повышенное содержание С049е+ и СЭ86+ макрофагов по сравнению с пациентками с неудачной попыткой ЭКО. Таким образом, успех проведения ЭКО зависит от ряда иммунологических показателей, отражающих, прежде всего, активность реакций врожденного иммунитета.
Ключевые слова: бесплодие, экстракорпоральное оплодотворение, фолликулярная жидкость, лимфоциты, фагоциты, цитотоксичность
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) становится рутинным методом лечения бесплодия различной этиологии. Его широкое распространение связано с тем, что ЭКО позволяет достичь беременности в тех случаях, когда невозможно применение других методов лечения, как, например, при трубно-перитонеальном бесплодии.
Адрес: 153009, Иваново, ул. Мякишева, д.5., кв. 24. E-mail: niimid.immune@mail.ru
Однако до сих пор эффективность ЭКО остается сравнительно невысокой и не превышает 35 — 40% [1]. Одним из перспективных путей повышения эффективности этого метода лечения является создание системы надежных прогностических критериев, позволяющих до начала овариальной стимуляции оценить шанс на успех наступления беременности и провести, в случае необходимости, необходимый комплекс лечебных мероприятий. Такие показатели, как сывороточное содержание ФСГ, анти-мюллерова гормона и ингибина В широко используются сейчас как предикто-
ры успешного получения ооцитов в протоколах ЭКО [2]. Однако эти показатели не позволяют прогнозировать эффективность других этапов ЭКО, в частности, наступления беременности и рождение ребенка. В настоящее время активно проводится поиск новых критериев, определяющих успех ЭКО, в том числе и иммунологических.
Известно, что иммунная система участвует в регуляции практически всех этапов процесса репродукции, а нарушения иммунологического контроля ведут к развитию бесплодия, являясь причиной неуспеха имплантации, невынашивания, преждевременных родов, задержки внутриутробного развития плода и т.д. [3]. Среди иммунных механизмов, определяющих успешное наступление и течение беременности, важную роль отводят изменению цитокинового баланса. Принято считать, что наступление беременности сопровождается усилением дифференцировки ^0 лимфоцитов в сторону ^2 клеток с одновременным подавлением активности провоспалительных реакций типа, являющихся потенциально опасными для развивающегося плода [3, 4]. Усиление активности реакций, опосредованных регуляторными Т-лимфоцитами, и поддержание баланса между ^17 лимфоцитами и Treg также играет важную роль в поддержании иммунологического равновесия во время беременности [3, 4, 5]. Многие авторы отмечают повышение содержания периферического пула CD56(dim)CD16(bright) лимфоцитов и усиление их цитотоксической активности у женщин с невынашиванием беременности и репродуктивными потерями в анамнезе [6, 7]. Считают, что развитие бесплодия может быть ассоциировано с усилением активности аутоиммунных процессов. Во многих работах указывается на повышение уровня циркулирующих анти-фосфолипидных антител у женщин, страдающих бесплодием и невынашиванием беременности [8].
Учитывая доказанную значимость иммунных механизмов в реализации репродуктивных процессов, можно предположить, что иммунологические показатели являются теми надежными критериями, которые позволят клиницистам прогнозировать эффективность лечения бесплодия и успех ЭКО.
Особый интерес в этом случае представляет изучение характера иммунных процессов на локальном уровне, а именно на уровне яичников. Показано, что цитокины фолликулярной жидкости играют важную роль в обеспечении
роста и созревания яйцеклетки [9]. Однако пока еще остается практически не изученным популяционный состав и особенности функционирования иммунокомпетентных клеток фолликулярной жидкости, участвующих в формировании микроокружения, в котором идут процессы созревания фолликула.
В связи с этим, целью нашего исследования было оценить особенности популяционного состава и функциональной активности лимфоцитов и фагоцитов периферической крови и фолликулярной жидкости у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в зависимости от наступления у них беременности после проведения ЭКО для определения возможности использования иммунологических показателей в качестве критериев прогноза успеха ЭКО.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты
Нами было обследовано 95 женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перито-неальным фактором (основная группа). Все пациентки участвовали в программе ЭКО. Выбор схемы стимуляции суперовуляции проводили с учетом овариального резерва пациенток. После проведения ЭКО наступление беременности было отмечено у 47 женщин основной группы, у 48 пациенток с бесплодием проведение ЭКО оказалось неэффективным.
Материалом для исследования служили образцы периферической крови и фолликулярной жидкости, полученные в момент забора яйцеклеток. Исследования были одобрены локальными этическими комитетами ФГБУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России и ГУ «Институт педиатрии, акушерства и гинекологии НАМН Украины» и проводились с информированного согласия пациенток.
Выделение мононуклеарных клеток крови и фолликулярной жидкости
Обогащенную популяцию мононуклеарных клеток (МНК) крови получали стандартным методом скоростного центрифугирования в плотности фиколл-верографина ^=1,078). При выделении МНК из фолликулярной жидкости (ФЖ) проводили предварительное центрифугирование образцов ФЖ в
течение 10 мин. Затем полученный осадок ре-суспендировали в 5 мл среды RPMI 1640 и центрифугировали в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-верографина (d = 1,06, d= 1,078). Клетки из интерфазы фиколл-ве-рографин (d= 1,078) - среда RPMI 1640 собирали, дважды отмывали и использовали для проведения проточной цитометрии в концентрации 1х106 кл/мл.
Проведение проточной цитометрии
Проводили определение содержания в периферической крови и фолликулярной жидкости основных популяций лимфоцитов (CD3 + , CD3 + CD4+, CD3 + CD8 + , CD3-CD16 + , CD3-CD56 + , CD19 + , CD19 + CD5 + ) и оценку экспрессии функциональных молекул (HLA-DR, CD16, CD11b, CD49e, CD86) на поверхности моноцитов/макрофагов с помощью набора моноклональных антител (Becton Dickinson, USA) на приборе FACSCan (Becton Dickinson, USA). В качестве негативного контроля использовали IgG1(FITC) и IgG2(PE) антитела (Becton Dickinson, USA). Анализ данных проводили с использованием программы CellQuest Pro. Не менее 10000 клеток анализировалось в каждом образце. Для построения лимфоцитарного и моноцитарного гейта клетки метили CD45 (FITC) и CD14(PE) антителами (Becton Dickinson, USA). В лимфоци-тарном гейте содержание CD45 + CD14- клеток было не менее 99,5%, а в моноцитарно/ макрофагальном гейте уровень CD45 + CD14+ клеток составлял не менее 97%.
Определение цитотоксической активности периферических лимфоцитов
Проводили определение цитотоксической активности периферических лимфоцитов, используя метод проточной цитофлюори-метрии. Клетки-мишени линии К562 метили флюоресцентной меткой CFDA (карбок-си-2,7-дихлорофлуоресцеин диацетат) Mol Probes (USA). Эффекторы (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяли на градиенте плотности Histopaque™-1077 («Sigma», USA). Клетки-мишени инкубировали с эффекторами в соотношениях 1/10 и 1/20 в течение 4 часов в культуральной среде RPMI 1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой при 370С и 5% СО2 («Revco», Switzerland).
Затем проводили окрашивание клеток про-пидием йодистым PI («Sigma», США), который метил мертвые (пермеабилизирован-ные) клетки. После определения уровня PI+ и CFDA+ клеток на проточном цитометре FACSCan (Becton Dickinson, USA) рассчитывали индекс цитотоксичности для каждого соотношения эффектор/мишень по формуле: % цитотоксичности = % PI+ клеток (мертвые клетки-мишени)/% CFDA+ (общее количество клеток-мишеней)х100.
Статистический анализ
Статистическую обработку данных проводили с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий между изучаемыми группами определяли по t-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При анализе содержания основных популяций лимфоцитов в периферической крови женщин с трубно-перитоне
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.