ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 111-118
УДК 581.1:577.17:577.12.05
ВЗАИМОСВЯЗЬ ИНТЕНСИВНОСТИ РОСТА КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ С ИХ ЭКСКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И КОЛИЧЕСТВОМ
ПОГРАНИЧНЫХ КЛЕТОК
© 2007 г. А. И. Божков, Ю. А. Кузнецова, Н. Г. Мензянова
Научно-исследовательский институт биологии Харьковского национального университета, Харьков
Поступила в редакцию 21.10.2005 г.
Исследовали экскрецию белков и углеводов у 1-дневных проростков пшеницы (Тпйсит aestivum L.) с низкой (НИР) и высокой интенсивностью роста (ВИР), количество пограничных клеток (ПК) у корней, а также влияние разных концентраций NaF (1, 5, 10 и 20 мМ) на скорость их роста при ВИР и НИР. Меньшая скорость роста корня на ранних этапах роста (1 сутки) сочеталась с высокой интенсивностью экскреции белков в среду, причем для углеводов - в меньшей степени. NaF в среде проращивания ингибировал рост корней и индуцировал экскрецию высокомолекулярных белков в среду, и это в большей степени проявлялось у корней с ВИР. Количество ПК не зависело от интенсивности экскреции белков в среду. Их количество было одинаковым у корней с ВИР и НИР, а при внесении 1мМ NaF количество ПК в среде увеличивалось в одинаковой степени у корней с ВИР и НИР. Увеличение концентрации NaF не влияло на количество ПК.
ТгШсит aestivum - корневые экзометаболиты - пограничные клетки - белки
ВВЕДЕНИЕ
В процессе жизнедеятельности корни растений выделяют в окружающую среду целый ряд различных химических соединений, называемых корневыми экзометаболитами [1]. В составе корневых экзометаболитов высших растений обнаружены аминокислоты, белки, липиды, углеводы, витамины и другие соединения [2-4]. Ранее было показано, что в процессе роста корня система экскреции экзометаболитов претерпевает значительные изменения: меняется состав, оптическая плотность, окислительно-восстановительный потенциал экзометаболитов [5]. Показано, что интенсивность выделения корневых экзометаболитов зависит от разнообразных факторов и сигналов: от температуры окружающей среды, от присутствия в среде патогенных микроорганизмов и различных фитотоксикантов [6, 7].
Известно, что основная роль в экскреции корневых экзометаболитов принадлежит так называемым пограничным клеткам корня (border cells, ПК) [8]. Эти клетки утратили механический контакт с корневым апексом и находятся в слизи,
Сокращения: ВИР - высокая интенсивность роста, НИР -низкая интенсивность роста, ПК - пограничные клетки. Адрес для корреспонденции: Божков Анатолий Иванович. 61077 Харьков, пл. Свободы, 4. Научно-исследовательский институт биологии Харьковского национального университета. Электронная почта: vlaschenko@yandex.ru
окружающей апекс. ПК представляют собой отдельную дифференцированную популяцию клеток, которой присущ отличный от клеток апекса и корневой меристемы профиль белков и РНК [9]. Величина популяции пограничных клеток и их метаболическая активность определяется факторами среды: концентрацией С02 и 02 в атмосфере и почве, наличием в среде тяжелых металлов и т.д. [10, 11]. Можно предположить, что качественный и количественный состав корневых экзометаболитов отражает функциональную активность популяции ПК, их пролиферативную и экскреторную активность. Работ, посвященных исследованию роли ПК в корневой экскреции, немного и они выполнены в основном на растениях семейств бобовых или пасленовых [12]. Показано, что активность ПК у злаковых в формировании ризосферы не столь выражена по сравнению с бобовыми [13]. Наряду с этим показано, что интенсивность корневой экскреции у пшеницы достаточно высока [5]. Исследование взаимосвязи экскреторной активности корней пшеницы с интенсивностью их роста и содержания в ризосфере ПК является необходимым этапом в понимании механизмов регуляции корневой экскреции и роста растений.
Известно, что NaF оказывает комплексное влияние на физиологические процессы в растительных клетках [14]. Прежде всего, его влияние проявляется в ингибировании роста растений. В экспериментах внесение NaF в среду позволяет контролировать интенсивность роста корней, что
Л
К
вч £
Рис. 1. Окраска пограничных клеток трипановым синим в корневом апексе однодневных проростков.
может быть использовано для изучения системы экскреции.
В задачи настоящей работы входило определение интенсивности экскреции белков и углеводов у корней с НИР и ВИР, влияние разных концентраций NaF в среде на рост и экскреторную активность корней с НИР и ВИР и на количество ПК в корневом апексе.
МЕТОДИКА
Объект исследования. Эксперименты проводили с 1-дневными проростками озимой пшеницы (ТгШсит aestivum L.) сорта Донецкая-48. В работе использовали семена урожая 2003 и 2004 гг.
Семена промывали 2 ч водой и в течение 10 мин 0.005%-ным раствором К2Мп04, после чего замачивали в дистиллированной воде в стеклянном плоском эксикаторе при 25°С в течение 21-22 ч. Затем отбирали проклюнувшиеся неповрежденные зерновки, раскладывали их в чашки Петри по 50 шт. в каждую, и вносили по 4 мл дистиллированной воды (контроль) или 4мл NaF (опыт) в концентрациях 1, 5, 10 или 20 мМ.
Через 24 ч измеряли длину корней, собирали корневые экзометаболиты, определяли их состав и подсчитывали количество ПК.
Сбор корневых экзометаболитов. Культураль-ную среду с корневыми экзометаболитами переносили из чашек Петри в пробирки. После этого проростки, не вынимая из чашек Петри, дополнительно промывали стерильной дистиллированной водой, которую затем объединяли с культу-ральной средой. Полученную смесь использовали для анализа состава корневых экзометаболитов, определяя в ней содержание общего белка, высокомолекулярных белков и углеводов.
Высокомолекулярные белки экзометаболитов осаждали 76%-ным этиловым спиртом в тече-
ние 12 ч при температуре 4°С. Полученные осадки высушивали, растворяли в 1 N NaOH, и в аликвотах определяли содержание белка по Low-ry [15].
Содержание углеводов определяли по Моли-шу [16]. Для этого к аликвотам корневых экзометаболитов добавляли 0.5 мл фенольного реактива. Пробы интенсивно перемешивали и вносили 2.5 мл концентрированной H2SO4. Через 20 мин определяли экстинкцию при длине волны 488 нм на спектрофотометре СФ-46 ("ЛОМО", Россия). Оценку содержания общих углеводов проводили с помощью калибровочной кривой для глюкозы.
Определение количества пограничных клеток in situ. В эксперименте определяли количество ПК, окружающих корень, in situ. Для этого по 20 корней 1-дневных проростков каждого варианта фиксировали в 2%-ном глютаровом альдегиде в течение 1 ч. Затем зафиксированные корни окрашивали 0.6%-ным трипановым синим в течение 15 мин, апикальные участки корней помещали в каплю воды на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и подсчитывали количество ПК в зоне апекса под световым микроскопом ("ЛОМО") (рис. 1). Результаты представлены количеством ПК в расчете на 1 корень.
Было проведено 5 независимых экспериментов. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние NaF на интенсивность роста корня
Длина корня к концу первых суток в контрольном варианте у проростков-2003 (урожай 2003 г.) достигала 0.9 см, в то время как корни пророст-ков-2004 (урожай 2004 г.) были в 2 раза длиннее (рис. 2). Столь существенные различия в интенсивности роста 1-дневных корней урожая разных лет могут быть связаны как с различием в сроках хранения семян, так и с различием климатических условий при формировании урожая. Однако независимо от этого можно утверждать, что корни проростков-2003 характеризуются низкой интенсивностью роста (НИР), а корни проростков-2004 -высокой интенсивностью роста (ВИР).
Инкубация проростков с NaF в разных концентрациях (1, 5, 10 и 20 мМ) в течение суток приводила к угнетению скорости роста корней (рис. 2). Однако степень ингибирования была разной у корней с ВИР и НИР. Так, если у корней с ВИР наблюдали значительное угнетение роста (в 2.5 раза при 20мМ по сравнению с контролем), то у корней с НИР это угнетение было менее выраженным (в 1.5 раза) (рис. 2).
Следовательно, NaF в концентрациях 1-20 мМ ингибировал рост корней пшеницы, и степень ингибирования была более выраженной у интенсивно
растущих проростков. Это позволяет предположить, что NaF угнетает интенсивно протекающие метаболические процессы, быстрее проникая в клетки проростков с ВИР и, тем самым, ингиби-рует ростовые процессы. Однако независимо от механизма, обеспечивающего этот эффект, можно утверждать, что, используя NaF, можно индуцировать ингибирование ростовых процессов в корнях.
Взаимосвязь интенсивности роста корня с их экскреторной активностью
Известно, что белковая фракция составляет от 47 до 65% корневых экзометаболитов и представлена как высокомолекулярными, так и низкомолекулярными компонентами [4].
В связи с этим определяли содержание общего и высокомолекулярного белка в среде культивирования проростков с НИР и с ВИР. Было обнаружено, что в культуральной среде корней с НИР содержание белка достигало 3.5 мкг белка в расчете на 1 корень (табл. 1). У корней с ВИР выявлялось в 2 раза меньше общего белка (1.57 мкг/корень). Следовательно, для корней с НИР характерен более высокий уровень экскреции общих белков, чем для ВИР, т.е. наблюдается обратная зависимость между интенсивностью роста корня и активностью корневой экскреции общих белков.
Можно полагать, что такая взаимосвязь характерна только лишь для корней с неиндуциро-ванной, естественной задержкой роста. Для выявления общего характера этой закономерности представляет интерес определить взаимосвязь между индуцированным ингибированием роста корней и активностью экскреторной системы. Для создания модельной системы использовали ингибирование роста корней NaF.
Было обнаружено, что, если NaF в концентрации 20 мМ ингибировал рост корней с НИР в 1.5 раза, то интенсивность экскреции белка при этом увеличивалась в 3.5 раза, т.е. сохранялась обратная зависимость между интенсивностью роста корня и активностью корневой экскреции (табл. 1). У корней с ВИР ингибирование скорости роста в 2.5 раза при внесении 20 мМ NaF сопровождалось усилением экскреции белка в 1.8 раза (рис.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.