ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 3, с. 343-349
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЗАИМОСВЯЗЬ РАЗЛИЧИЙ В УСТОЙЧИВОСТИ К ЗАМОРОЗКАМ АРАБИДОПСИСА И ТЕЛЛУНГИЕЛЛЫ С СОДЕРЖАНИЕМ БЕЛКОВ
ТЕПЛОВОГО ШОКА И ДЕГИДРИНОВ © 2014 г. К. З. Гамбург, Н. Е. Коротаева, Б. К. Бадуев, Г. Б. Боровский, В. К. Войников
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений
Сибирского отделения РАН, Иркутск Поступила в редакцию 12.02.2013 г.
Растения экстремофила теллунгиеллы (Thellungiella salsuginea (Pall.) O.E. Schulz) выдерживали заморозки до —15°С в течение 2 ч без закаливания, тогда как растения арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heinh) в этих условиях повреждались при —10°С и погибали при —15°С. Содержание белков теплового шока (БТШ, или HSP) HSP101, HSP60 и конститутивного HSC70 в незакаленных растениях Thellungiella было значительно выше, чем у незакаленных растений Arabidopsis. Спектр дегид-ринов (ДГ) у незакаленных растений Thellungiella был более разнообразным, а их общее содержание было выше, чем у таких же растений Arabidopsis. После закаливания (4°С, 7 суток), которое увеличивало устойчивость Arabidopsis к заморозкам, происходило повышение содержания HSP101 и HSP60, а также содержания ДГ с мол. м. 70 кД. Растения Thellungiella после закаливания выживали при —18°С, при этом повышение содержания HSP101, HSP70 и HSP60 было значительно более слабым, чем у Arabidopsis. В то же время у Thellungiella при закаливании существенно возрастало содержание ДГ, главным образом за счет появления двух ДГ (с мол. м. 42 и 45 кД). Предполагается, что одним из факторов устойчивости Thellungiella к низким температурам, по сравнению с Arabidopsis, может быть повышенное содержание HSP и ДГ и их большее разнообразие.
Ключевые слова: ЛгаЫйорн1н ^аНапа — Тке11ищ1е11а закщтва — устойчивость к заморозкам — закаливание — белки теплового шока — дегидрины
DOI: 10.7868/S0015330314030051
ВВЕДЕНИЕ
Наиболее широко используемым модельным растением при изучении механизмов молекуляр-но-генетического управления биохимическими и физиологическими процессами у растений является ЛгаЫйор$15 ЛаНапа (Ь.) НешЬ (сем. Вга88Ь сасеае или СгасИегае), геном которого полностью расшифрован [1]. Однако ЛгаЫйор$15 не обладает высокой устойчивостью к абиотическим стрессам, хотя те или иные экспериментальные модификации генома в какой-то степени изменяют ее. Необходимость найти естественные генетические детерминанты высокой устойчивости к низким температурам и замерзанию, к засолению и засухе заставила обратиться к поиску других модельных объектов, обладающих такой устойчиво-
Сокращения: ДГ — дегидрин, ПВПП — поливинилполипир-ролидон, HSP — белок теплового шока (от heat shock protein), HSC — конститутивный белок теплового шока (от heat shock cognate protein).
Адрес для корреспонденции: Коротаева Наталья Евгеньевна. 664033 Иркутск-33, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Электронная почта: knev73@yandex.ru
стью. Thellungiella salsuginea, другой представитель сем. Brassicaceae, выбрана как потенциальный модельный объект для изучения устойчивости к абиотическим стрессам [2]. Thellungiella не только обладает теми же признаками, что и Arabidopsis, но и является "экстремофилом", способным выдерживать засоление 500 мМ NaCl [3] и выживать при замораживании до —19°С [4, 5]. Растение имеет небольшой геном с высокой степенью идентичности последовательностей (в среднем 92—95%) по отношению к геному Arabi-dopsis, что позволяет использовать генетические средства, разработанные для Arabidopsis (microar-ray чипы, праймеры и др.), при работе с Thellungiella. Существует несколько видов рода Thellungiella [6]. Наиболее часто при изучении механизмов устойчивости к абиотическим стрессам используют вид Thellungiella salsuginea (Pall.) O.E. Schulz, имеющий несколько экотипов. Эко-тип Shandong, происходящий из засоленных прибрежных территорий Китая, используется главным образом для изучения механизмов устойчивости к солевому стрессу, а экотип Yukon из Канады — для изучения устойчивости к холоду и
замораживанию. При этом оба экотипа обладают повышенной, по сравнению с Arabidopsis, устойчивостью как к засолению, так и к замораживанию [4, 5, 7].
Наиболее интенсивно изучаются молекуляр-но-генетические механизмы высокой устойчивости теллунгиеллы к засолению [2, 8], тогда как механизмы ее устойчивости к холоду и заморозкам исследовались в ограниченном числе работ. Inan с соавт. [5] показали, что после недельного закаливания при 4°С растения Thellungiella (экотип Shandong) выдерживали заморозки до —15°С в течение суток, тогда как растения арабидопсиса в таких же условиях погибали. Растения Thellungiella экотипа Yukon без закаливания и при 7-дневном закаливании выдерживали заморозки до — 13°С, после 14-дневного закаливания — до — 18.5°С, после 4-дневной засухи и 7-дневного закаливания — до —21°С; при этом обработка холодом перед заморозками сопровождалась изменением транскрипции большого числа генов, связанных с адаптацией к холоду [4]. Однако, как показали авторы, высокая устойчивость теллун-гиеллы к замораживанию не была связана с продукцией инициаторов образования льда (ice nu-cleators) и антифризных белков [4].
В большинстве работ адаптация теллунгиеллы к холоду рассматривалась на уровне транскрипто-ма [4, 5, 7]. Протеомный анализ реакции этого растения на пониженную температуру (4°С) представлен в работе Gao с соавт. [9]. С помощью двумерного электрофореза было выявлено 66 белков, содержание которых в этих условиях изменялось. Выдерживание на холоде сопровождалось накоплением дегидринов (ДГ) и белков теплового шока (БТШ, или HSP от heat shock proteins) HSP70. Сопоставления с Arabidopsis в отношении накопления определенных белков и устойчивости к низкой температуре этими авторами не проводилось.
Адаптация к низкой температуре у растений, как правило, сопровождается накоплением водорастворимых белков, среди которых особую роль играют ДГ, способные, благодаря их уникальному аминокислотному составу, связывать значительное количество воды и соединяться с белками и липидами для предотвращения повреждений, вызванных обезвоживанием [10]. Их экспрессия может индуцироваться различными воздействиями, вызывающими дегидратацию цитоплазмы, в том числе и пониженными температурами. У Arabi-dopsis идентифицировано 6 генов, кодирующих ДГ, среди них Cor47, Rab18, Lti10, Lti30, Erd14. Основными ДГ, индуцируемыми холодом, являются Cor47и LTI30 [11].
Другая группа белков, тесно связанных со многими абиотическими стрессами, — это белки теплового шока (HSP). Синтез этих белков у Ara-
bidopsis и Thellungiella вызывается повышенными температурами, что приводит к возникновению у них индуцированной термотолерантности [12]. HSP как часть системы неспецифической адаптации участвуют в регуляции устойчивости не только к высоким температурам, но и к другим стрессам [13]. Так, например, у Thellungiella было обнаружено увеличение транскрипции белка семейства HSP70 (локус At5g02 500) под влиянием холода, засухи и засоления [7, 14]. Этот белок выполнял функцию конститутивного шаперона, так как содержался в листьях, не подвергавшихся тепловому шоку. Хотя у ряда растений была показана индукция различных HSP при низкотемпературном стрессе [15, 16], неизвестно, насколько их содержание важно для развития закаленного состояния и устойчивости к отрицательной температуре.
Глобальные исследования реакции протеома на те или иные абиотические стрессы, при которых выявляются изменения содержания нескольких сотен белков (причем функции многих еще неизвестны) должны быть дополнены более детальным изучением отдельных групп белков, связь которых с реакцией на эти стрессы считается более или менее установленной.
В настоящей работе мы сравнили устойчивость к заморозкам незакаленных и закаленных при 4° С растений арабидопсиса и теллунгиеллы и сопоставили ее с изменениями в составе и содержании двух групп белков — ДГ и HSP.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал, низкотемпературное закаливание и воздействие отрицательных температур. В работе использовали семена Arabidopsis thaliana (L.) Heinh (раса Columbia), периодически репродуцируемые в институте. Семена Thellungiella salsuginea (Pall.) O.E. Schulz экотипа Shandong были любезно предоставлены B.A. Moffat (University of Waterloo, Канада) и репродуцированы в нашем институте.
Замоченные семена после 4-дневного выдерживания при 4°С в темноте переносили в ростовую комнату (23°С, 16/8 ч день/ночь) и культивировали 2 недели. После этого проростки распикировывали по 3 штуки в рассадные горшочки диаметром 4.5/5.0 см с торфогрунтом ("Фарт", Россия), содержащим 150 мг/л (NH4 + NO3), 270 мг/л P2O5 и 300 мг/л К2О, к которому добавляли 25% вермикулита (размер частиц 3—5 мм). Дальнейшее выращивание проводили в той же ростовой комнате в течение двух недель для Arabi-dopsis и четырех недель для Thellungiella, поскольку для того, чтобы достичь одинакового этапа роста и развития, пригодного для опытов, теллунгиелле требовалось больше времени, чем арабидопсису.
Выросшие растения переносили на одну неделю в климатическую камеру ("Binder KBW 240", Германия) с люминесцентным освещением 16 ч в сутки для закаливания при температуре 4°С. Такой режим закаливания используется во многих работах (например, при закаливании Arabidopsis [17, 18] и Thellungiella [4, 9]).
После 7 дней закаливания срезали листья у части закаленных и незакаленных растений для выделения белка. Для выявления у закаленных и незакаленных растений устойчивости к заморозкам их выдерживали 2 ч при отрицательной температуре в жидкостном термостате KRIO-VT-Ol ("Термекс-2", Россия). Температуру внутри камеры контролировали электронным термометром. Температуры промораживания (—10, —15 и — 18°С) выбирали, исходя из известных значений повреждающих температур для Arabidopsis [17, 18] и Thellungiella [4, 5]. Продолжительность холодо-вого воздействия (2 ч) подбирали в ходе предварительных экспериментов; для этого оценивали действие различно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.