БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2004, том 30, № 5, с. 458-465
УДК 577.112.6.017:577.18.03
ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРА-АКТИВНОСТЬ В РЯДУ АНАЛОГОВ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДА ИНДОЛИЦИДИНА. I. СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНАЛОГОВ С УВЕЛИЧЕННОЙ АМФИПАТИЧНОСТЫО И ПОВЫШЕННЫМ ОБЩИМ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ ЗАРЯДОМ МОЛЕКУЛЫ © 2004 г. М. П. Смирнова, В. Г. Афонин, В. М. Шпень, Ю. В. Тяготин, Н. И. Колодкин"
ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, 197110, Санкт-Петербург, ул. Пудожская, 7 Поступила в редакцию 14.07.2003 г. Принята к печати 15.04.2004 г.
Твердофазным методом синтезирован антибактериальный пептид индолицидин и ряд его аналогов. Предложен оптимизированный метод синтеза с использованием Вос-технологии. Показано, что в ряду синтезированных аналогов индолицидина усиление общего положительного заряда молекулы и увеличение амфипатичности сопровождается повышением терапевтического индекса, т.е. при сохранении антибактериальной активности гемолитическая активность в измеренных диапазонах концентраций практически отсутствует.
Ключевые слова: индолицидин, антибактериальные пептиды, взаимосвязь структура-активность, твердофазный синтез пептидов, триптофан, антимикробная активность.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы в медицинской практике все чаще стали наблюдаться случаи резистентности ряда патогенов к широко используемым классическим антибиотикам. Для лечения инфекций, вызванных такого рода патогенами, необходимы антибиотические средства нового поколения. К ним можно отнести, прежде всего, антибактериальные (антимикробные) генкодируемые пептиды, широко распространенные в различных организмах и являющиеся компонентой естественного иммунитета [1]. По сравнению с классическими антибиотиками они уничтожают микроорганизмы гораздо быстрее, а самое главное, развитие к ним резистентности, исходя из механизма действия [1], маловероятно.
Антибактериальные пептиды, многие из которых активны в отношении широкого ряда микроорганизмов, включая бактерии, дрожжи, грибы, простейшие и т.д. [2], были выделены из самых разнообразных организмов, начиная с бактерий и кончая млекопитающими.
Побочным эффектом действия антимикробных пептидов является их довольно высокая цитотокси-ческая активность в отношении нормальных клеток, например эритроцитов (гемолитическая активность), поэтому практический интерес пред-
Сокращения: 1п(1 - индолицидин; Рогт - формил; - ме-зитиле нсул ьфонил. #Автор для переписки (тел.: (812) 230-49-53; эл. почта: Kolodkin@hpb.spb.ru).
ставляют антимикробные пептиды или их аналоги с высокой антимикробной активностью, имеющие низкую цитотоксическую активность в отношении здоровых эукариотических клеток [3].
Среди многочисленных антибактериальных пептидов привлекает особое внимание тридекапеп-тид - индолицидин (Пе-Ьеи-Рго-Тф-Ьуз-Тгр-Рго-Тф-Тгр-Рго-Тгр-А^-А^-]ЧН2), впервые выделенный из цитоплазматических гранул бычьих нейтрофи-лов [4]. Это обусловлено в первую очередь широким спектром его биологической активности: он активен в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий и грибов [4—7], а также обладает ингибирующей активностью в отношении вируса иммунодефицита человека первого типа [8] и высокой гемолитической активностью [7]. Кроме того, индолицидин имеет уникальную химическую структуру. В его состав входят пять триптофановых остатков (в настоящее время не известны другие природные пептиды такой длины со столь высоким уровнем индо-лизации молекулы), три пролина и основные аминокислоты. Все эти аминокислоты, как известно, крайне важны для пептид-липидных взаимодействий, через которые реализуется начальная реакция пептида с микроорганизмом, и замена их в природной молекуле должна существенно изменять антибактериальную активность [9].
Целью настоящей работы было выявление структурных параметров молекулы индолицидина, влияющих на антибактериальную и гемолитичес-
кую составляющие его спектра активности с последующим получением соединений с селективной активностью, то есть обладающих высоким антимикробным и низким гемолитическим эффектами,
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение взаимосвязи структура-активность в ряду аналогов индолицидина позволило выявить следующие закономерности. Было обнаружено, что делеция С-концевого аргининамида ведет к снижению антибактериальной активности [8]. Кроме того, было показано, что аналоги, в которых все остатки пролина заменены на аланиновые или все остатки триптофана - на фенилаланино-вые, имели антибактериальную активность, сравнимую с активностью исходного соединения [10]. Авторы пришли к достаточно спорному, с нашей точки зрения, выводу, что как пролин, так и триптофан не существенны для проявления молекулой антибактериальной активности.
Хэнкок и Фалла [6] получили аналог индолицидина с большим, чем природная молекула, положительным зарядом и амфипатичностью (Ие-Ьеи-Ьуз-Ьуз-Тф-Рго-Тф-Рго-Тгр-Тгр-Рго-Тгр-А^-Аг§-МН2), который обладал повышенной антибактериальной активностью.
Л им и др. [11] описали восемь аналогов индолицидина. Среди них [С1/'6]1пс1, [Иеб'8]1пс1, [Ьу812]1пс1 и [Т1иг2,Туг9]1пс1 показали повышенную антибактериальную активность. Их результаты подтверждают функциональную значимость пролинов и положительно заряженных аминокислотных остатков. Стаубитц и др. [12] синтезировали большую серию аналогов индолицидина, которая включала укороченные последовательности, точечные аланиновые замены, аналоги, в которых остатки триптофанов и пролинов были замещены на ароматические, гидрофобные, основные и кислые аминокислоты. Кроме того, были получены ретро- и инверсо-аналоги самого индолицидина и аналога, в которых все остатки триптофана были замещены на фенилаланин.
Антимикробная активность фенилаланиново-го аналога индолицидина была сходной с таковой для природной молекулы, однако гемолитичес-
кая активность была на порядок ниже. Интересно, что антимикробные активности как ретро-, так и инверсо- и ретроинверсо-аналогов индолицидина и [РЬе4Д8-9'11]1пс1 были сравнимы с активностями исходных молекул. Этот факт в достаточной степени подтверждает независимость антимикробного эффекта пептида от наличия специфического рецептора или рецептороподоб-ной молекулы, так как рецепторопосредованный механизм предполагает зависимость как от хи-ральности, так и от аминокислотной последовательности молекулы. Уменьшение же гемолитической активности полученных ретро-, инверсо-и ретроинверсо-аналогов может являться, по мнению авторов, результатом изменения общего дипольного момента молекулы, что существенно для клетки - эритроцита.
Антимикробная активность аналогов, в которых триптофан и аргинин (лизин) были замещены на кислые аминокислоты: аспарагиновую и глута-миновую [12], была гораздо ниже, чем у индолицидина, что, казалось бы, подтверждало решающий вклад общего положительного заряда молекулы в реализацию эффекта. Однако аналог с полным замещением триптофанов на лизины, имеющий высокий положительный заряд, был также не активен. То есть, сильно влияя на специфическую активность, общий положительный заряд молекулы является лишь одним из определяющих структурных факторов, необходимым для ее проявления.
Фредрич и др. [13] исследовали аналог индолицидина, в котором остатки пролинов замещены на остатки аланинов, обладающих способностью усиливать образование а-спиральных участков. Спектры КД аналога в водных растворах и триф-торэтаноле свидетельствовали о наличии спиральных структур. Более того, при взаимодействии с липидами происходила дальнейшая индукция образования спиральной структуры.
Для оценки влияния амфипатичности на биологическую активность модифицированной молекулы природного пептида мы построили амфи-патическую спираль Эдмудсона [14] индолицидина (I) (рис. 1) и для более полного разделения гидрофильной и гидрофобной частей спирали провели ряд замен гидрофобных аминокислот гид-
11е-Ееи-Рго-Тф-Ьу8-Тф-Рго-Тф-Тф-Рго-Тгр-А^-Аг§-]чЩ2 (I) 11е-Ьеи-Рго-Тгр-А1а-Тф-Рго-Тф-Тф-Рго-Тгр-А^-Аг§-1ЧН2 (II) Ие-Ьув-Рго-Тгр-Ьув-Тф-Рго-Тф-Ьув-Рго-Тф-АЫ-А^-ННд (III) Ие-Ьув-Рго-Тгр-Ьуз-Тф-Рго-Тф-Ьув-Рго-Тгр-А^-А^-КГНг (IV) 11е-Ьу8-Рго-Тф-Ьу8-Ьу8-Рго-Тф-Ьу8-Рго-Тф-А^-А^-ГуЩ2 (V) Ьуз-Ьув-Рго-Тф-Ьув-Тф-Рго-Ьув-Ьуз-Рго-Тф-А^-А^-КНт (VI) 11е-Ьу8-Ьу8-Тф-Ьу8-Ьу8-Рго-Тф-Ьу8-Ьу8-Тгр-А^-А^-НН2 (VII)
Выделены основные аминокислотные остатки.
Рис. 1. Проекции амфипатических спиралей индолицидина (I) и его аналогов (II)—(VII). Темные и светлые кружки -соответственно гидрофобные и гидрофильные аминокислотные остатки. В центре показан общий положительный заряд молекулы.
рофильными. Учитывая, что, в соответствии с литературными данными [15], увеличение общего положительного заряда молекулы должно способствовать усилению антимикробных свойств, в качестве гидрофильной аминокислоты для модификации молекулы индолицидина была выбрана основная аминокислота - лизии (аналоги (1ЛНУП)). Амфипати-ческие спирали аналогов представлены на рис. 1. Для сравнения была построена также спираль аналога (II), в котором замена положительно
заряженной аминокислоты лизина в положении 5 на аланин наоборот приводила к снижению общего положительного заряда молекулы и, как видно из рис. 1, уменьшала ее амфипатичность.
Как сам индолицидин, так и все его аналоги, описанные в литературе, были синтезированы твердофазным методом [16], причем, как правило, использовалась Ртос-технология [7, 10, 17]. При этом были найдены оптимальные условия синтеза и комбинации защитных группировок.
Ранее Андреу и Гарсиа разработали удобный способ получения индолицидина с помощью Вос-технологии, сделав в основном упор на оптимизацию условий конечного деблокирования [18]. Мы же, оптимизируя синтез индолицидина по Вос-технологии, уделили большее внимание оценке использования различных сочетаний защитных группировок трифункциональных аминокислот -триптофана и аргинина (табл. 1). Выбор направления исследования продиктован тем, что индольные кольца остатков триптофана (а их в молекуле 5) легко подвергаются нежелательным химическим превращениям, а для защитных групп гуанидино-вой функции аргинина требуются достаточно жесткие кислые условия деблокирования.
Твердой матрицей служил м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.