БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 2, с. 249 - 255
УДК 577.123
ЯДЕРНЫЙ ФАКТОР ТРАНСКРИПЦИИ Y (NF-Y) ТОРМОЗИТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ИНГИБИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ ФАКТОРА SOX2 В КЛЕТКАХ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ КАРЦИНОМЫ ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ NT2/D1*
© 2015 М. Мойсин**, В. Топалович, Д. Марьянович Висентич, М. Стеванович
Institute of Molecular Genetics and Genetic Engineering, University of Belgrade, 11010 Belgrade, Serbia; fax: +381(11)397-5808, E-mail: mojsin@imgge.bg.ac.rs, vladankatopalovic@imgge.bg.ac.rs, jelenamarjanovic@imgge.bg.ac.rs, milenastevanovic@imgge.bg.ac.rs
Поступила в редакцию 01.08.14 После доработки 22.09.14
Ядерный фактор NF-Y относится к факторам транскрипции эмбриональных стволовых клеток и принимает участие в регуляции клеточной пролиферации. В данной работе исследована роль NF-Y в поддержании по-липотентного состояния клеток NT2/D1 — наиболее хорошо изученной линии эмбриональной карциномы человека в культуре. Проведен анализ метода белковой трансдукции и показано, что он является эффективным способом повысить уровень экспрессии А субъединицы NF-Y (NF-YA) в клетках NT2/D1. Осуществлена трансдукция в клетки NT2/D1 гибридного белка GST-TAT-NF-YAs, несущего укороченную форму NF-YA (NF-YAs), и изучено ее влияние на пролиферацию клеток NT2/D1. Установлено, что при повышенной экспрессии NF-YAs пролиферативный потенциал клеток NT2/D1 значительно падал, и это повышение оказывало негативное воздействие на продукцию ими фактора транскрипции SOX2, являющегося специфическим маркером полипотентных стволовых клеток. И наконец, оценка уровня экспрессии белка р53 свидетельствовала, что процесс торможения роста клеток NT2/D1 под действием NF-Y был р53-независимым.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фактор транскрипции NF-Y клетки линии NT2/D1, SOX2, p53.
Клетки N72/01 — это одна из наиболее хорошо охарактеризованных линий клеток эмбриональной карциномы человека, которая широко используется для изучения характерных признаков полипотентных клеток, путей их дальнейшего развития и дифференцировки [1, 2]. Эти клетки похожи на эмбриональные стволовые клетки человека по набору экспрессированных специфических генов и характеру метилирования ДНК [3]. Помимо этого, полипотентные клетки №Г2/01 способны развиваться по ней-рональному, мезодермальному и эктодермаль-ному пути [1, 4]. В связи с тем, что использование эмбриональных клеток человека сталкивается с рядом этических и правовых проблем, культура клеток N72/01 может служить в качестве адекватной модели для изучения развития эмбрионов человека [5].
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-228, 25.01.2015.
** Адресат для корреспонденции.
Ядерный фактор транскрипции Y (NF-Y) может выступать в качестве как активатора, так и ингибитора транскрипции [6—8]. Он регулирует активность генов-мишеней путем взаимодействия с блоком нуклеотидов CCAAT — широко распространенным контрольным элементом, встречающимся в проксимальных промоторах, тканеспецифических генах-усилителях и в длинных терминальных повторах отдельных подклассов эндогенных ретровирусов человека [7, 9]. NF-Y представляет собой белковый комплекс, состоящий из трех различных субъединиц: NF-YA, NF-YB и NF-YC. Считается, что субъединица NF-YA является в этом комплексе ведущей и необходима как для образования цельного NF-Y, так и для его специфического связывания с ДНК [10]. Обнаружено несколько изоформ NF-YA, образующихся в результате дифференциального сплайсинга. В частности, тканеспецифический альтернативный сплайсинг приводит к образованию двух основных изоформ этого белка: короткой (NF-YAs) и длинной (NF-YAl), которые различаются на 28 аминокислотных остатков
(а.о.) в активирующем транскрипцию домене, обогащенным остатками Gln [11]. Ранее было показано, что укороченная изоформа NF-YAs была активна в эмбриональных стволовых клетках мыши, где она активировала клеточную пролиферацию и подавляла дифференцировку [12].
Одним из признаков эмбриональных стволовых клеток и индуцированных полипотентных клеток является экспрессия фактора транскрипции SOX2 [13—16]. Его экспрессия строго регулируется в процессе развития клетки, поскольку го-меостаз уровней важнейших факторов транскрипции необходим не только для поддержания полипотентного состояния клеток, но и для торможения их перехода к дифференцировке [17]. Как было отмечено нами ранее, фактор транскрипции NF-Y регулирует экспрессию некоторых генов SOX человека (SOX2, SOX3, SOX14 и SOX18) в клетках линии NT2/D1 [18-22]. Это активирующее воздействие NF-Y обусловливается, по крайней мере, отчасти, его связыванием со специфическим блоком CCAAT в промоторах генов-мишеней и путем взаимодействия с другими факторами, участвующими в регуляции транскрипции генов SOX человека [18-24]. Для выяснения роли NF-Y в поддержании полипотентно-го состояния клеток эмбриональной карциномы человека, мы изучали характерные фенотипичес-кие черты клеток линии NT2/D1, экспрессирую-щих большое количество белка NF-Y. Использованный нами подход был ранее применен при исследовании человеческих гемопоэтических клеток-предшественников [25] и эмбриональных стволовых клеток мыши [12]. Вместо традиционной трансфекции вектора экспрессии мы прямо вводили в клетки гибридный белок GST-TAT-NF-YAs методом белковой трансдукции (эпитоп TAT способствует быстрому транзиту этого гибридного протеина через клеточную мембрану, GST — глутатион S-трансфераза) [12, 25].
В представленной работе была проведена оценка эффективности использованной нами процедуры белковой трансдукции для повышения уровня экспрессии NF-Y в клетках NT2/D1, выбранных в качестве модели эмбриональных стволовых клеток человека. Кроме того, было изучено проявление некоторых характерных признаков стволовых клеток (пролифератив-ный потенциал и продукцию специфического маркера SOX2) в культуре NT2/D1 после транс-дукции экспрессии изоформы NF-YAs. Установлено, что белковая трансдукция является эффективным методом повышения экспрессии NF-Y в клетках NT2/D1. При изучении влияния NF-YAs на жизнеспособность клеток NT2/D1 было обнаружено значительное снижение их пролиферативного потенциала. Мы отметили
прямую корреляцию между повышением уровня экспрессии NF-YAs и снижением продукции маркерного белка SOX2 в клетках NT2/D1. И наконец, оценка уровней экспрессии белка p53 показала, что она не повышалась после транс-дукции в клетки гибридного белка GST-TAT-NF-YAs. Поскольку уже сама процедура транс-дукции фрагмента GST-TAT (отрицательный контроль) приводила к увеличению уровня p53, то мы предположили, что ингибирование роста клеток NT2/D1 под действием NF-Y является р53-независимым.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культура клеток и трансдукция белков. Клетки линии NT2/D1, любезно предоставленные проф. П.В. Эндрю (Шеффилдский университет, Англия), выращивали в среде Дульбекко (DMEM) в присутствии 10%-ной фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глутамина, 0,45%-ной глюкозы и пенициллина/стрептомицина («Invitrogen», США) при 37° в атмосфере 10%-ной CO2 как было описано ранее [2, 26]. Перед трансдукцией клетки высевали в 6-лу-ночные планшеты (0,3 х 106 клеток в лунке).
Гибридные белки GST-TAT-NF-YAs и GST-TAT были любезно предоставлены проф. Р. Ман-товани. Трансдукцию белков в клетки NT2/D1 выполняли как было описано ранее [12]: к клеткам добавляли 50 нМ белка и инкубировали в течение 48, 72 или 96 ч со сменой среды каждые 24 ч. Клетки подсчитывали вручную с использованием трипанового синего.
Вестерн-блоттинг. Клетки лизировали в 20 мМ Tris-HCl-буфере, pH 8,0, содержавшем 5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1%-ный NP-40, 10%-ный глицерин и коктейль из ингибиторов протеаз («Roche Diagnostics GmbH», Швейцария). Для иммуноблоттинга использованы анти-NF-YA Mab1a (любезно предоставлены проф. Р. Манто-вани), анти^ОХ2 антитела («R&D Systems», США), анти-р53 антитела DO1 («GeneSpin», Италия), антитела против а-тубулина DM1A («Calbiochem», Германия) и анти-GAPDH антитела AM20337PU-S («Acris Antibodies, Inc.», Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проверка эффективности трансдукции белка GST-TAT-NF-YAs в клетки Ш2/Ш. Для оценки эффективности метода белковой трансдукции была использована процедура, использованная
ранее Мантовани и соавт. [12] при трансдукции GST-TAT-NF-YAs в эмбриональные стволовые клетки мыши. Клетки NT2/D1 инкубировали с белком GST-TAT-NF-YAs или GST-TAT (отрицательный контроль) в концентрации 50 нМ в течение 48, 72 или 96 ч. После этого клетки ли-зировали, и белки клеточных лизатов анализировали методом Вестерн-блоттинга. Результаты, представленные на рис. 1, свидетельствовали, что транслокация GST-TAT-NF-YAs в клетки происходила уже на 48 ч инкубации, и через 72 ч концентрация этого белка в клеточных лизатах достигала очень высоких значений. Дальнейшая инкубация (96 ч) ни только не приводила к увеличению уровня экспрессии GST-TAT-NF-YAs, но даже сопровождалась его снижением. Таким образом, было показано, что белковая трансдук-ция является очень эффективным методом введения GST-TAT-NF-YAs в клетки NT2/D1, и что максимальное количество белка накапливалось к клетках через 72 ч после начала трансдукции.
Воздействие трансдуцированного белка GST-TAT-NF-YAs на жизнеспособность клеток NT2/D1. Ранее было установлено, что при экспрессии укороченной изоформы субъединицы NF-YA (белок NF-YAs) наблюдалась стимуляция роста эмбриональных стволовых клеток человека и ге-мопоэтических клеток-предшественников человека [12, 25]. Для проверки воздействия GST-TAT-NF-YAs на клетки NT2/D1 мы осуществляли его трансдукцию в течение 48 и 72 ч, а затем подсчитывали количество живых клеток с использованием трипанового синего. Как следует из рис. 2, экспрессия GST-TAT-NF-YAs в клетках NT2/D1 приводила к снижению скорости клеточной пролиферации на 50% — через 48 ч и на 60% — через 72 ч. Использованный в качестве отрицательного контроля белок GST-TAT не оказывал ингибирующего воздействия на рост клеток. Полученные результаты совпадали с наблюдениями Гатнера и соавт. [27], которые показали, что NF-Y индуцировал E2F1- и р53-зависимый апоптоз в эмбрион
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.