ш
УДК 577.322.5:543.422.25
ЯМР-ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ДИНАМИКИ ХИМЕРНОГО БЕЛКА 8НА-Б СЕМЕЙСТВА "8Н3-БЕРЖЕРАК"
© 2010 г. В. С. Христофоров*, Д. А. Прохоров*, М. А. Тимченко*, Ю. А. Кудреватых*, Л. В. Гущина**, В. В. Филимонов**, В. П. Кутышенко*#
*Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3;
**Учреждение Российской академии наук Институт белка РАН, Московская обл., Пущино Поступила в редакцию 16.12.2009 г. Принята к печати 29.01.2010 г.
Методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения проведено структурно-динамическое исследование одного из химерных белков (ЗНА-Б) семейства "ЗНЗ-Бержерак", у которого Р-поворот N47—048 в спектриновом ЗНЗ-домене заменен на последовательность КАТАЛФКТУЕ. На основе данных ЯМР определена пространственная структура белка и исследована ее динамика в растворе. Удлинение полипептидной цепи ЗНА-Б по сравнению с исходным белком WT-SH3 (~17%) практически не отражается на общей топологии молекулы. ЯМР-структура белка ЗНА-Б почти полностью идентична структурам других представителей семейства "ЗНЗ-Бержерак", но имеются определенные отличия в динамических характеристиках в месте вставки. Замена G52D в Р-повороте ЗНА-Б приводит к дестабилизации вставки, в которой возникают условия для конформационного обмена. Эта дестабилизация транслируется на всю молекулу ЗНА-Б, структура которой становится более лабильной.
Ключевые слова: БИ3-домен, белок БИЛ-В семейства "8И3-Бержерак", пространственная структура, динамика, ЯМР.
ВВЕДЕНИЕ
SHS-домены (Src homology region 3 domains) представляют собой маленькие белковые модули, участвующие в регуляторных белок-белковых взаимодействиях [1]. Природные SH3-домены входят в состав крупных мультидоменных белков, участвующих в передаче сигналов и других клеточных процессах, многие из которых связаны с развитием тех или иных заболеваний, благодаря чему SH3-доме-ны стали важными мишенями для дизайна лекарственных препаратов [2—6]. Считается, что регуля-торная функция SH3-доменов осуществляется через их слабое взаимодействие с обогащенными пролином участками белков-партнеров длиной 8— 10 остатков [7—10].
Сокращения: SH3 — Src-гомологичный домен 3; Src — тиро-зинкиназа вируса саркомы Рауса; WT-SH3 — рекомбинант-ный белок с последовательностью спектринового домена дикого типа; SHH, SHA и SHA-D —химерные варианты WT-SH3 семейства '^Ю-Бержерак"; РСА— рентгенострук-турный анализ; ЯЭО — ядерный эффект Оверхаузера; NOESY — двумерная спектроскопия ЯЭО; COSY — двумерная корреляционная спектроскопия; TOCSY— полная корреляционная спектроскопия; HSQC — гетероядерная однокванто-вая корреляционная спектроскопия; PDB — банк белковых структур; RMSD — среднеквадратичное отклонение; тт — время корреляции белка как целого. # Автор для связи (тел.: (4967) 73-92-26; факс: (4967) 33-05-53; эл. почта: kutyshenko@rambler.ru).
Ввиду малых размеров и хорошо изученных структурных характеристик изолированные SH3-домены и их модификации довольно широко используются в качестве объектов для физико-химических и структурных исследований различными методами [11—13]. Особый интерес представляет формирование вторичной структуры белка и ядер сворачивания, а также количественная оценка движущих сил этих процессов [14, 15]. Структура SH3-доменов обычно формируется в одну стадию, а наиболее упорядоченным элементом основного переходного состояния является так называемая ди-стальная шпилька [1, 11]. В случае спектринового SH3-домена она включает короткий Р-поворот первого типа N47—D48 (рис. 1).
В целях модификации структуры ядра сворачивания было создано более десяти химерных вариантов SH3-домена, в которых Р-поворот N47—D48 в дистальной шпильке заменен на декапептиды, различающиеся по своей аминокислотной последовательности [16]. В исходном варианте SHH (рис. 1) аминокислотная последовательность вставки подбиралась так, чтобы обеспечить максимальную вероятность образования Р-структуры на этом участке за счет включения в него гидрофобного кластера IVY, противопоставления двух остатков треонина и образования наиболее стабильного Р-поворота. Предполагалось, что такая вставка приведет к удлинению существующей дистальной Р-шпильки, и
WT-SH3
Рх
р2
вз
Р4
р5
3Х0
X 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
MDETGKELVLALYDYQEKSPREVTMKKGDILTLLNSTNKDWWKVEV ND RQGFVPAAYVKKLD X 5 10 15 20 25 30 35 40 45 У V 60 65 70
SHA-D K A TA ND K T Y E 50 55
SHA KATA NG KTYE SHH K I TV NG KTYE
Рис. 1. Аминокислотные последовательности исходного белка WT-SH3 и его вариантов SHH, SHA и SHA-D. Сверху показана схема вторичной структуры WT-SH3 по данным РСА [17], где стрелками обозначены участки Р-тяжей. Вставки из десяти остатков для химерных белков семейства «ЗЮ-Бержерак» показаны внизу жирным шрифтом, а р-повороты в них обозначены курсивом.
она будет выступать за пределы домена в виде жесткого "носа", в связи с чем это семейство химерных белков получило название "Бержерак". В других членах семейства перечисленные структурные элементы поэтапно удалялись: так, в варианте SHA гидрофобный кластер IVY был сильно редуцирован путем замены остатков изолейцина и валина на ала-нины (рис. 1), что привело к понижению стабильности структуры не только "носа", но и всей химерной конструкции [18]. С целью дальнейшего изучения влияния точечных замен на стабильность Р-шпиль-ки нами был сконструирован вариант SHA-D, где остаток G52 в Р-повороте был заменен на остаток аспарагиновой кислоты, которая присутствует в SH3-домене дикого типа.
К настоящему времени накоплено достаточное количество термодинамической и кинетической информации по белкам семейства "Бержерак" [16, 18, 19], которая нуждается в адекватной структурной интерпретации. Недавно при помощи метода ЯМР-спектроскопии мы установили пространственную структуру двух химерных белков семейства "SH3-Бержерак" (SHA и SHH) [20, 21], а для белка SHH дополнительно получили рентгенографическую структуру [18]. В данной работе методом гетероядерной спектроскопии ЯМР определена пространственная структура химерного рекомби-нантного белка SHA-D и проведено исследование ее динамики.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для последовательного отнесения ЯМР-сигна-лов к определенному остатку в первичной структуре SHA-D (рис. 1) были получены препараты 15N- и 13С-меченного белка. Комбинация трех- и двумерных гетероядерных ЯМР-экспериментов с применением градиентов магнитного поля позволила провести практически полное отнесение сигналов ядер 15N, 13С и протонов (см. "Эксперимент. часть"), что является необходимым условием расчета простран-
ственной структуры. Как результат одного из этапов отнесения на рис. 2 представлен X5N-HSQC-спектр белка SHA-D.
На основании полученных данных ЯМР была рассчитана пространственная структура SHA-D (см. "Эксперимент. часть"). Исходные данные и статистика, полученная в ходе расчета структуры, приведены в таблице. На рис. 3 представлены данные расчета величин локальных RMSD основной цепи белков SHA-D и SHA из набора 20 структур с минимальным значением целевой функции. Значения RMSD почти для всех аминокислотных остатков выше для SHA-D, что особенно характерно для участка "носа". В то же время статистика показывает (см. таблицу), что число регистрируемых ЯЭО-контактов для SHA-D меньше по сравнению с SHA (код доступа PDB 2rmo). При одинаковых экспериментальных условиях получения ЯМР-данных для SHA и SHA-D это может означать, что SHA-D имеет более высокую внутримолекулярную подвижность.
Окончательная модель наиболее вероятного варианта пространственной структуры SHA-D (рис. 4а) содержит пять антипараллельных Р-структурных участков, образующих характерный для этого семейства "бочонок" [17]. Как и в ЯМР-структурах белков SHH и SHA семейства "Бержерак" [21], тяжи р3 и р4 образуют длинный антипараллельный Р-лист, характерно закрученный в виде пропеллера и выступающий за пределы глобулы в виде "носа". В структуре SHA-D по сравнению с SHA имеется только одно отличие: в 12 случаев из 20 в полученном ансамбле структур остатки 48, 49, 50 и 53, 54, 55 р3- и р4-тяжей, соответственно, не принимают участия в образовании Р-структуры кончика «носа», превращая Р-поворот в петлю. Таким образом, в результате постадийного введения трех дестабилизирующих замен в оптимизированную шпильку, реализованную в варианте SHH (рис. 1), ее структура оказывается развернутой.
Кроме того, отметим, что ароматическая область X3C-HSQC-спектра содержит два набора сигналов,
- 105
- 110
- 115
.д.
Я
Ъ
5
- 120
- 125
- 130
Рис. 2. Спектр 15N-HSQC 1 мМ раствора химерного белка 8ИЛ-В при 298 К в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, содержащем 0.03% №N3, рН 3.5. Обозначения -кросс-пиков соответствуют номерам остатков в аминокислотной последовательности. Сигналы, принадлежащие №Н-протонам боковых групп глутамина и аспарагина, соединены линиями, которые помечены номерами остатков.
16
49Я 64в 21J5Í-T3Z-
40 38 '35. ' 38
' 10_J5
4
'37. 35._
65,
^ 27. 38/ Л. 41 70
15 58 56 18* 393 ■ 29.
36
36 1207 2 57 7 8 41
9 47
42 43 55
68 34 42_ 33,
24
10
9 8
1H, м.д.
59
58
61
5
13
9
16
62
51
54
14
67
60
51
30
22
17
16
41
63
7
относящихся к 8- и е-протонам Туг55 с соотношением интенсивностей 3 : 1. Это означает, что помимо представленной на рис.4а основной конформа-ции белка, может существовать еще одна, имеющая совершенно другую ориентацию кольца Туг55 и остатков, образующих кончик "носа". При расчете структуры с конформацией, соответствующей менее заселенному состоянию, было изменено лишь отнесение 8- и е-протонов остатка Туг55. Следует сказать, что в спектре ЯЭО для этого положения Туг55 кросс-пики не обнаруживаются, но они присутствуют между его амидным и И2Св-протонами. Такое возможно, скорее всего, потому, что в этой конформации кольцо Туг55 осуществляет настолько быстрые флип-флопы, что сигналы ЯЭО резко уменьшаются по амплитуде из-за высокой локальной подвижности — ю0тЛг ~1. Вариант пространственной структуры с конформацией, соответствующей менее заселенному состоянию для Туг55, представлен на
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.