МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 455-460
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.28:581.2
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОРАСТАНИЯ КОНИДИЙ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
© 2004 г. Л. М. Полянская*, Т. Е. Толстихина*, Г. А. Кочкина**, Н. Е. Иванушкина**, Д. Г. Звягинцев*
*Факулътет почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 07.08.03 г.
Изучены особенности ауторегуляции прорастания конидий культур фитопатогенных микромице-тов родов Fusarium, Botrytis и Bipolaris. Показано, что Trichoderma longibrachiatum уступает в конкурентоспособности Fusarium oxysporum, однако при обеспечении первой конкурентных преимуществ путем более раннего внесения, она может оказывать на культуру фитопатогена ингибирующее воздействие. Показано, что при воздействии T. longibrachiatum на F. oxysporum для последней утрачивает значение фактор аутоингибирования и, напротив, проявляется кооперативный эффект.
Ключевые слова: микромицеты, фитопатогены, конидии, прорастание, ауторегуляция, конкуренция, ингиблирование.
Фитопатогенные микроорганизмы - постоянные спутники сельскохозяйственного производства. Значительная часть заболеваний вызывается разнообразными микромицетами [1]. Преимущественное внимание фитопатологов уделяется биологии фитопатогенных грибов и механизмам поражения растений [2]. Изучается и экология фитопатогенных популяций, однако в этой области твердо установленных данных накоплено все еще недостаточно. Между тем, современное земледелие требует оптимизации борьбы с заболеваниями посевов, при этом требования активности, экологической безопасности и рентабельности средств защиты растений входят в противоречие [3]. Для совершенствования методов подавления фитопатогенных микроорганизмов необходимо знать причины вспышки их численности на тех или иных субстратах, а для этого следует изучать механизмы регуляции численности этих популяций. Поэтому все большее значение приобретает применение в практике биологической защиты растений грибов-антагонистов, в том числе представителей рода ТпсЬойвгта [4-7]. Показано, что культуры рода ТпсЬойвгта широко распространены как участники микробных сообществ здоровых растений [8].
Активно изучается влияние различных параметров внешней среды на поведение микробных популяций. Однако помимо внешних факторов в экологии значительную роль играют внутрипопуляцион-ные взаимодействия. В литературе имеются указания на существование механизмов ауторегуляции процесса активизации покоящихся форм микроорганизмов [9-11]. Изучение ауторегуляции прорастания покоящихся форм микромицетов в чистых и
смешанных культурах является важным шагом в оценке их экологических стратегий и прогнозе взаимодействий в естественной среде обитания.
Целью настоящей работы являлось изучение особенностей внутрипопуляционной регуляции прорастания конидий спор фитопатогенных микромицетов и ее влияние на конкурентоспособность этих популяций в отношении грибов рода ТпсНойвгта.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследованные культуры фитопатогенных микромицетов были получены из коллекции ВКМ ИБФМ РАН. Три отобранных для работы штамма являются типичными представителями родов Fusarium, Botrytis и Bipolaris: Fusarium oxysporum Schlechtendal emend. Snyger et Hansen FW-387, Botrytis cinerea Persoon: Fries FW-401; Bipolaris sorokiniana (Saccardo) Schoemaker BKM F-3045.
Культура Trichoderma longibrachiatum Rifai FW-829 была выделена нами из ризопланы тепличных роз [8].
Для получения конидий микромицеты культивировали на агаризованной среде с пептоном и глюкозой (пептон - 5 г, глюкоза - 10 г, KH2PO4 -1 г, MgSO4 - 0.5 г, вода - 1 л, агар - 20 г) в течение 7 сут при 28°C. Затем смывом получали суспензию конидий, которую трижды отмывали H2O, осаждая центрифугированием, и затем с помощью ультразвуковой обработки (УЗДН-1, 22 кГц, 0.44 A, 30 с) получали моноконидиевую суспензию. Микроконидии гриба F. oxysporum FW-387
%
100 80 60 40 20
у = 56.4ln(x) + 10.5 R = 0.9163
у = 49.8ln(x) + 10.8 R = 0.91
у = 9.8ln(x) + 0.11 R = 0.95
. -Ъ-
10
20
30
40
50 ч
Рис. 1. Динамика прорастания микроконидий Р. охуя-рогит в зависимости от среднего расстояния между конидиями: 1 - 50, 2 - 35 и 3 - 13 мкм. Я - коэффициент корреляции.
получали путем фильтрования суспензии через фильтр с диаметром пор 10 мкм.
Для определения жизнеспособности конидий грибов из моноконидиевой суспензии готовили препараты по стандартной методике [12]. Суспензии конидий наносили микропипеткой на тщательно обезжиренные предметные стекла (0.04 мл на препарат для фитопатогенных микромицетов и 0.02 мл - для культур рода ТгкЬойегта) и равномерно распределяли петлей на площади 4 см2. Для одного образца готовили 12 препаратов и просматривали по 50 полей зрения в каждом. Расчет количества конидий в 1 мл суспензии (популяционная плотность) проводили по формуле:
N = 81ап/ vS2,
где N - число конидий в 1 мл суспензии, 51 - площадь препарата (мкм2); а - количество конидий в одном поле зрения (усреднение производится по всем препаратам); п - показатель разведения суспензии; V - объем капли, наносимой на стекло (мл); 52 - площадь поля зрения микроскопа (мкм2).
Плотность популяции и отсутствие признаков прорастания конидий определяли на препаратах, зафиксированных и окрашенных сразу после приготовления мазков. Для установления способности конидий к прорастанию приготовленные препараты до высыхания мазков помещали во влажную камеру и инкубировали при температуре воздуха 28°С и влажности 100% в течение 6, 15, 18, 24 и 39 ч. После инкубирования препараты высушивали на воздухе, фиксировали и окрашивали калькофлуором белым [13]. Учет конидий производили с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ И-3. Площадь поля зрения составляла 9800 мкм2. В качестве индекса обилия использовали среднее расстояние между конидиями: г = л/Т/4ш , где г - расстояние, т - популяционная плотность в расчете на единицу площади (а/9800 мкм2). Число конидий в поле зрения (а), равное 0.1, 1, 2, 5, 10, 15, 20 и 40, соответствовало популяционной плотности 1 х 105, 1 х 106, 2 х 106,
5 х 106, 1 х 107, 1.5 х 107, 2 х 107 и 4 х 107 конидий в 1 мл и среднему расстоянию между конидиями 156, 50, 35, 22, 15, 13, 11 и 8 мкм.
Для показателя численности конидий доля среднего квадратичного отклонения (5n _ х) не превышала 10%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 отражена динамика прорастания конидий в препаратах микромицета F. oxysporum. Можно видеть, что процесс прорастания конидий во влажной камере зависит от их плотности. Прорастание конидий регистрируется к 15-му ч инкубирования. Уже на этом этапе наблюдаются существенные различия между препаратами. При плотности конидий, составляющей 1-5 клеток в поле зрения (среднее расстояние между конидиями 50-22 мкм), к 15-му ч прорастает более 50% конидий, а при плотности в 15 клеток (среднее расстояние между конидиями 13 мкм) - только 5.7%. В дальнейшем к 18-му ч инкубирования наблюдается увеличение доли проросших конидий на всех препаратах примерно в 1.5 раза. При плотности 1 клетка в поле зрения к концу опыта прорастают практически все конидии, около 90% конидий прорастает и при плотности 5 клеток в поле зрения. При плотности конидий 15 клеток к 24-му ч инкубирования доля проросших конидий стабилизируется на уровне 16% и в дальнейшем не меняется. При плотности конидий 20 клеток (среднее расстояние между конидиями 11 мкм) в поле зрения не наблюдалось их прорастания в течение всего срока инкубирования. Необходимо отметить, что при низкой плотности клеток прорастают пропорционально и микро-, и макроконидии (рис. 2а, 26), а при плотности 15 клеток в поле зрения прорастают исключительно макроконидии (рис. 2в, 2г). Процесс прорастания конидий во всех случаях описывается уравнениями логарифмической регрессии (с достаточно высокими коэффициентами корреляции R = 0.91-0.95).
При исследовании прорастания конидий другого фитопатогенного микромицета - Bot. cinerea характер прорастания был несколько иным (рис. 2д, 2е; рис. 3). При плотности 1 клетка в поле зрения доля проросших конидий достигает 50% лишь к 18-му ч инубирования, затем численность проросших спор увеличивается, составляя к концу опыта 95%. При плотности 5 клеток в поле зрения доля проросших конидий достигает 1113% к 15-18-му ч инкубирования, увеличивается к 24-му ч в 3 раза и в дальнейшем не меняется. Таким образом, доля проросших конидий при плотности 5 клеток в поле зрения снижается более чем в 2 раза по сравнению с долей проросших спор при плотности 1 клетка в поле зрения. Процесс прорастания конидий здесь также описывается уравнениями логарифмической регрессии с
1
2
3
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОРАСТАНИЯ КОНИДИЙ 457
Рис. 2. Прорастание конидий F. oxysporum в зависимости от популяционной плотности (при низкой плотности прорастают и микро- и макроконидии (а, б), при плотности более 15 спор в поле зрения - исключительно макроконидии (в, г)). Прорастание конидий Bot. cinerea (д, е). Увеличение Х1000.
высокими коэффициентами корреляции (R = = 0.91-0.98). Таким образом, по сравнению с F. oxysporum, Bot. cinerea оказался более чувствительным к фактору популяционной плотности. При повышении плотности с 1 до 5 клеток в поле зрения в первом случае количество проросших конидий снижается примерно на 10%, а во втором -в 3 раза. При плотности 15 клеток в поле зрения конидии культуры Bot. cinerea не прорастали.
Процесс прорастания конидий у микромицета Bip. sorokiniana при плотности 1 клетка в поле зрения аналогичен процессам прорастания у описанных выше грибов: конидии прорастают к 15-му ч инкубирования, доля проросших конидий в это время достигает 50%. При плотности 0.1 клетка в поле зрения (среднее расстояние
между конидиями 156 мкм) к 15-му ч прорастает более 70%, к 18-му ч доля проросших конидий в обоих вариантах достигает 100 или почти 100% и
%
Рис. 3. Динамика прорастания конидий Bot. cinerea (%) в зависимости от среднего расстояния между конидиями (мкм). Обозначения, как на рис. 1.
Рис. 4. Зависимость относительного содержан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.