ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 422, № 4, с. 564-567
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.463+612.432.018
ЗАМЕНА L-АРГИНИНАф) НА Я-АРГИНИН(8) УСТРАНЯЕТ НАТРИЙУРЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ АНАЛОГОВ ВАЗОТОЦИНА У КРЫС
© 2008 г. А. В. Кутина, И. И. Елисеев, М. И. Титов, академик Ю. В. Наточин
Поступило 27.05.2008 г.
Аргинин-вазотоцин является антидиуретическим гормоном большинства позвоночных животных. Он увеличивает всасывание натрия и воды клетками кожи и мочевого пузыря амфибий, усиливает реабсорбцию воды в почке птиц, рептилий [1]. У млекопитающих в нейрогипофизе вырабатывается вазопрессин, а не вазотоцин. Нами было показано, что инъекция крысе аргинин-вазотоцина вызывает уникальный эффект - он резко увеличивает выделение натрия почкой, угнетая его реабсорбцию в почечных канальцах [2]. Представляло интерес синтезировать новые аналоги этого гормона в попытке найти еще более эффективные натрийуретики, так как они могут иметь клиническое применение, и выяснить, какие особенности молекулы аргинин-вазо-тоцина имеют ключевое значение для реализации этого нового физиологического эффекта, связанного с угнетением реабсорбции натрия в почечных канальцах. В задачу настоящего исследования входил синтез новых аналогов аргинин-вазотоцина с заменой £-аргинина(8) на О-арги-нин(8), а также аминокислот в 4-м и 7-м положениях молекулы. Выбор замены в 8-м положении был обусловлен известным фактом, что замена £-аргинина(8) на О-аргинин(8) в молекуле вазо-прессина сопровождается появлением нового но-напептида - десмопрессина, обладающего необычным свойством: он увеличивает проницаемость эпителия для воды, но не обладает сосудосуживающим действием, не вызывает повышения артериального давления [3].
Эксперименты проводили на самках крыс линии Вистар с массой тела 150-220 г в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными. Аргинин-ва-
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург Санкт-Петербургский государственный университет
зотоцин и его аналоги растворяли в 0.9%-ном растворе хлорида натрия и вводили внутримышечно в дозах от 0.0001 до 0.1 нмоль на 100 г массы тела. Ненаркотизированных животных помещали в клетки-пеналы с проволочным полом, через отверстия которого моча стекала по воронке в пробирку. Выделение мочи регистрировали при спонтанном мочеотделении, измеряли объем мочи, концентрацию в ней креатинина определяли кинетическим методом по реакции Яффе на автоматическом биохимическом анализаторе EOS Bravo W (Италия). Концентрацию ионов натрия в сыворотке крови определяли на анализаторе электролитов AVL 9140 (США), в моче - в воз-душно-пропановом пламени на пламенном фотометре Corning-410 (Великобритания).
Все аналоги были синтезированы твердофазным методом на амино-2-хлортритильной смоле с использованием следующих аминокислотных производных: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-D-Arg-OH, Fmoc-L-Arg-OH, Fmoc-homoArg-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, P-Mpr(Acm)-OH. В качестве конденсирующего средства использовался диизо-пропилкарбодиимид или бензотриазол-1-ил-ок-си-трис-пирролидино-фосфоний гексафторфос-фат в присутствии оксибензотриазола. Снятие со смолы с одновременным удалением защитных групп трет.-бутильн ого типа проводили с помощью трифторуксусной кислоты в присутствии скевенджеров (вода, триизопропилсилан, этанди-тиол). Acm-защищенные пептиды обрабатывали раствором иода в водной (80%) уксусной кислоте, полученные продукты подвергали очистке с помощью обращеннофазной жидкостной хроматографии. Чистота полученных продуктов (95%+) проверялась аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографией, структура подтверждалась масс-спектрами.
В нашем исследовании использованы следующие аналоги аргинин-вазотоцина Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 (AVT):
ЗАМЕНА Ь-АРГИНИНА(8) НА £-АРГИНИН(8)
565
с ¿-аргинином
Мгг>Тут-11е-01п-Аяп-Суя-Рго-/ют/оАга-01у^Н2 (Ы-ИАУТ),
Мгр-Туг-11е-01п-А8п-Су8-01у-Ага-01у-КН2 (1ё-7в1у-АУТ),
Мгр-Туг-11е-ТИг-А8п-Су8-Рго-Ага-01у-КН9 (1ё-4ТИг-АУТ);
с Д-аргинином
Мгр-Туг-11е-01п-А8п-Су8-01у-Р-Ага-01у-КН2 (Ы-7в1у-Д-АУТ),
Мгр-Туг-11е-ТИг-А8п-Су8-Рго-Р-Ага-01у-КН9 (Ы-4ТИг-Д-АУТ),
Мгр-Туг-Т1е-01п-А8п-Су8-Рго-Р-Ага (Ы-ёе01у-Д-АУТ).
Все данные представлены в виде М ± т. Для сравнения средних показателей использовался од-нофакторный дисперсионный анализ (АКОУА), а при обнаружении неравенства средних для выявления отличающихся групп применялся критерий Ньюмена-Кейлса. Различия считались статистически значимыми при р < 0.05.
После инъекции крысам ¿-аргинин-вазотоци-на или синтезированных аналогов на основе ¿-ар-гинина в 8-м положении молекулы пептида наблюдалось увеличение мочеотделения, через 120 мин оно не отличалось от нормальных исходных значений (рис. 1). Диурез возрастал в 1.54 раза. Обращает внимание, что инъекция вазо-тоцина, который уменьшает скорость образования мочи у амфибий и птиц [1], или его синтетических аналогов крысам вызывала не уменьшение мочеотделения (антидиурез), а возрастание выведения мочи (полиурическая реакция) (рис. 1).
Ответ на вопрос о механизме такой необычной реакции дает анализ состава выделяющейся мочи. Под влиянием пептида выросла экскреция натрия почкой (рис. 2), который выводится вместе с осмотически связанной с ним водой. Известно, что натрий поступает в просвет почечного канальца в результате фильтрации в почечных клубочках, большая часть его всасывается, а остальная - удаляется с мочой. Следовательно, увеличение экскреции натрия с мочой могло происходить либо из-за большей его фильтрации в просвет канальца, либо снижения его обратного всасывания в кровь из просвета канальца. Для выяснения способа внутрипочечной реакции на пептид было сопоставлено выделение креатинина и натрия почкой, рассчитана экскретируемая фракция натрия (рис. 3). Этот метод позволяет рассчитать, меняется ли клубочковая фильтрация, ка-нальцевая реабсорбция или секреция изучаемого вещества в почке. Полученные данные свидетельствуют о том, что инъекция синтезированных пептидов повышает долю нереабсорбируе-
Диурез, мл/мин на 100 г массы 0.04 г
0 30 60 90 120 150 180 210 240
Время, мин
Рис. 1. Влияние инъекции аргинин-вазотоцина или его аналогов в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела на мочеотделение у крыс. Здесь и на рис. 2, 3 стрелка -момент введения препарата.
Ц^У, мкмоль/мин на 100 г массы 8
6 4 2
0 30 60 90 120 150 180 210 240
Время, мин
Рис. 2. Влияние инъекции аргинин-вазотоцина или его аналогов в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела на выделение ионов натрия почкой крысы.
на 100 г массы, %
25
20 15 10 5
0 30 60 90 120 150 180 210 240
Время, мин
Рис. 3. Влияние инъекции аргинин-вазотоцина или его аналогов в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела на экскретируемую фракцию ионов натрия почкой крысы.
566
КУТИНА и др.
Ц-аУ за 2 ч, мкмоль на 100 г массы
Пептид, нмоль на 100 г массы тела
Рис. 4. Зависимость экскреции натрия почкой крысы от дозы введенного аргинин-вазотоцина или его аналогов.
мого в канальцах натрия ультрафильтрата, и он подвергается экскреции. Следовательно, под влиянием всех исследованных пептидов с ¿-аргинином в 8-м положении молекулы гормона уменьшалась реабсорбция ионов натрия в канальцах почки и возрастала его экскреция с мочой. Этот эффект зависел от дозы введенного пептида (рис. 4).
Иные результаты были получены после инъекции аналогов вазотоцина, у которых в молеку-
лу пептида был введен О-аргинин. В отличие от аналогов с ¿-аргинином в 8-м положении молекулы их инъекция не вызывала изменения экскреции ионов натрия (рис. 2, табл. 1).
Проведенные исследования показали роль замены ряда аминокислот в молекуле нонапептида вазотоцина на его способность влиять на функции почек. Замена в 4-м положении глутамина на треонин в кольцевой части молекулы 1-дезамино-аргинин-вазотоцина сохраняет его натрийурети-ческие свойства по сравнению с наблюдающимися у аргинин-вазотоцина. Аналогичная картина выявлена после замены аргинина в 8-м положении на гомоаргинин. Замена пролина на глицин в 7-м положении или удаление глицина в 9-м положении приводит практически к полной потере натрийуретических свойств у аналога нона-пептида.
Ранее нами было показано, что дезаминирова-ние аргинин-вазотоцина усиливает его натрий-уретическое действие у крыс по сравнению с исходной молекулой гормона [4]. Результаты настоящего исследования указывают на зависимость натрийуретического действия от типа оптического изомера аминокислоты в 8-м положении - замена ¿-аргинина на О-аргинин полностью устраняет способность гормона влиять на систему ре-абсорбции натрия в почечных канальцах. Так как ранее нами было показано, что влияние пептидов на реабсорбцию натрия устраняется антагонистом Угрецептора [5], можно предполагать необходимость наличия ¿-аргинина для взаимодействия именно с рецептором этого типа. Эти данные имеют не только теоретическое, но и
Таблица 1. Особенности химического строения синтезированных аналогов аргинин-вазотоцина и влияние их инъекции на выделение ионов натрия почкой крысы
Условие опыта N Замена аминокислот Ц-аУ
1 4 7 8
Контроль(п = 48) 20 ± 3
ДУТ (п = 10) 9 Суз 01п Рго 110±16*
Ы-701у-£-ДУТ (п = 12) 9 Мгр 01п 01у 28 ± 7
Ы-4ТЬг-£-ДУТ (п = 10) 9 Мгр ТЬг Рго 16 ± 2
Ы^е01у-£-ДУТ (п = 9) 8 Мгр 01п Рго 27 ± 9
Ы-701у-ДУТ (п = 10) 9 Мгр 01п 01у 51 ± 8
Ы-4ТЬг-ДУТ (п = 10) 9 Мгр ТЬг Рго 132±25*
Ы-ЬДУТ (п = 13) 9 Мгр 01п Рго ¿-ЬошоД^ 143 ± 21*
Примечание. п - число опытов, N - число аминокислотных остатков в молекуле аналога; Ц-аУ - экскреция ионов натрия, мкмоль на 100 г массы тела за 2 ч после инъекции крысам аналога в дозе 0.05 нмоль на 100 г массы тела; * - различия с контролем статистически значимы прир < 0.001. 1, 4, 7, 8 - положение молекулы.
ЗАМЕНА Ь-АРГИНИНА(8) НА 0-АРГИНИН(8)
567
прикладное значение, поскольку в молярном выражении способность увеличивать выделение натрия почкой у изученных аналогов значительно превышает по силе действия один из самых эффективных современных натрийуретиков, каким является ф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.