ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 6, с. 847-855
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЗАЩИТНАЯ РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ, ИНДУЦИРОВАННОМ В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА
© 2007 г. Л. В. Дубовская, Е. В. Колеснева, Д. М. Князев, И. Д. Волотовский
Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Белоруссии, Минск
Поступила в редакцию 13.12.2006 г.
Оксид азота при экзогенном применении его донора нитропруссида натрия и пероксид водорода оказывают на листья табака антагонистическое (микромолярные концентрации) или синергетиче-ское (миллимолярные концентрации) действие. При Н2О2-индуцированном окислительном стрессе NO, действуя при низких концентрациях, подавлял перекисное окисление липидов, фрагментацию тотальной ДНК и препятствовал увеличению содержания растворимых белков в клетках Ыевиапа plumbaginifolia. При высоких концентрациях NO индуцировал каспазо-подобную активность, вызывал деградацию ДНК и растворимых клеточных белков, уменьшал синтез АТФ. Полученные результаты находятся в соответствии с гипотезой о двойственной роли NO в растениях, выступающего в качестве антиокислителя (перехватчика активных форм кислорода) и сигнального медиатора. Есть основания полагать, что, независимо от механизма действия, при окислительном стрессе в листьях табака оксид азота выполняет протекторную роль, поскольку даже при высоких концентрациях он оказывал не мгновенное токсическое действие, а запускал программируемую гибель клеток через активацию каспазо-подобных протеаз.
Ключевые слова: МеоЫапа plumbaginifolia - апоптоз - АТФ - каспазы - перекисное окисление липидов - содержание белка - фрагментация ДНК.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что проявлением окислительного стресса у растений является избыточное образование таких активных форм кислорода (АФК), как пероксид водорода (Н202), супероксид и гид-роксильные радикалы. Генерация АФК может быть обусловлена действием множества абиотических и биотических стимулов, включая экстремальные температуры, озон, УФ-излучение и видимый свет, фитогормоны, патогены и элисито-ры, дегидратацию, механическое повреждение, обработку гербицидами. Образование пероксида водорода является ключевым событием при водном дефиците, действии патогенов и других стрессовых факторов. Окислительный стресс приводит к повреждению практически всех компонентов клетки. При высоких концентрациях оксиданты вызывают перекисное окисление липидов (ПОЛ), фрагментацию ДНК, деградацию
Сокращения: АФК - активные формы кислорода, МДА -малоновый диальдегид, ПКС - программируемая клеточная смерть, ПОЛ - перекисное окисление липидов, cPTЮ -2-(4-карбоксифенил)-4,5-дигидро-4,4,5,5-тетраметил-1Н-ими-дазол-1-илокси-3-оксид калия, - нитропруссид натрия. Адрес для корреспонденции: Дубовская Людмила Вячеславовна. 220072 Минск, ул. Академическая, 27. Институт биофизики и клеточной инженерии НАНБ. Факс: (37517) 284-23-59; электронная почта: dubovsk@mail.ru
РНК и белков и утечку ионов из внутриклеточных мембранных компартментов [1].
Известно также, что одним из самых распространенных и сильных эффекторов в редокс-регу-лируемой сигнализации и иммунных ответах в животной клетке является оксид азота (N0). За последние несколько лет получен ряд результатов, свидетельствующих об участии N0 в защитных реакциях растений на изменения условий окружающей среды. В частности, было обнаружено, что N0 обладает способностью уменьшать последствия окислительного стресса, обусловленного действием бипиридиновых гербицидов. Ве%ш и Ьашайта [2, 3] продемонстрировали, что N0 в низких концентрациях частично предотвращает некроз клеток, снижение содержания хлорофилла и белка, а также подавляет ПОЛ и деградацию РНК в листьях картофеля, обработанных гербицидом дикватом.
Однако имеются данные о том, что N0 при высоких концентрациях в результате сильного инги-бирования цитохромной цепи способен воздействовать на функциональную активность митохондрий, ослабляя общее клеточное дыхание [4]. Также показано, что, наряду с Н2О2, оксид азота вызывает в культурах клеток программируемую клеточную смерть (ПКС, апоптоз) [5-9].
Следует отметить, что механизм раздельного и совместного действия оксида азота и пероксида водорода в растительной клетке в настоящее время окончательно не установлен. Кроме того, неизвестны механизмы, лежащие в основе адаптации, апоптической или некротической смерти клетки в условиях повышенной концентрации оксида азота и пероксида водорода.
Поэтому целью нашей работы было оценить влияние и направленность действия донора NO -нитропруссида натрия широко используе-
мого при изучении растительных и животных систем, на образование малонового диальдегида (МДА) при ПОЛ, фрагментацию ДНК, содержание клеточных растворимых белков, активацию каспазо-подобных протеаз и содержание АТФ в цитозоле клеток табака на фоне повышенного содержания Н2О2.
МЕТОДИКА
В качестве объекта исследования использовали листья 56-дневных растений табака МеоНапа plumbaginifolia, выращенных в стерильных условиях на МС-среде при температуре 25°С в режиме 15-часового светового дня и освещении полихро-матичным белым светом (150 мкЕ/(м2с)).
Из срезанных листьев табака вырезали участки листовой пластинки, удаляя средние жилки. Обработку фрагментов листьев эффекторами производили в течение определенных временных интервалов при тех же условиях, что и при выращивании. Контролем служили листья табака, проинкубированные в воде.
Определение содержания МДА. 100 мг ткани листьев гомогенизировали в 2 мл раствора, содержавшего 15% ТХУ (вес/объем), 0.5% тиобарбиту-ровой кислоты, 0.25% хлористоводородной кислоты. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали на водяной бане в течение 25 мин, затем центрифугировали в течение 10 мин при 1000 g и отбирали супернатант для определения оптической плотности при длине волне 535 нм. Концентрацию МДА рассчитывали по формуле:
[МДА] = ^535^,
где а - коэффициент молярной экстинкции МДА: а = 1.56 х 105 (М см)-1.
Выделение тотальной ДНК проводили по стандартной методике из замороженной в жидком азоте и растертой в ступке растительной ткани с помощью цетилтриэтиламмоний бромид (ЦТАБ)-содержащего буфера [10]. Степень фрагментации тотальной растительной ДНК регистрировали гель-электрофоретическим методом в 1.5%-ном агарозном геле.
Определение концентрации белка. Листья табака гомогенизировали в 50 мМ глицерофосфат-
ном буфере (рН 7.4), содержавшем 20 мМ ЭДГА, 15 мМ MgCl2, 1 мМ 1,4-дитиотрейтола (ДТТ) и 5 мМ NaF (буфер А), с добавлением 1% (вес/объем) поливинилполипирролидона, 1% (по весу) коктейля ингибиторов растительных протеаз, 500 мкМ Na3VO4, 10 мкМ NH4MoO4 и 2 мМ ДТТ, при соотношении массы растительного материала (г) к объему буфера (мл) - 1 : 2. Гомогенат фильтровали и осветляли центрифугированием при 113000 g 30 мин. Супернатант использовали в качестве фракции растворимых цитозольных белков. Все операции проводили при температуре 4°С. Для измерения применяли метод Bradford [11] с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.
Определение активности каспаз. Фракцию растворимых цитозольных белков, полученную описанным выше способом, использовали для люминесцентного анализа активности каспаз-3/7. Определение проводили с использованием набора Caspase-Glo 3/7 Assay ("Promega", США). Согласно протоколу производителя, люминогенный субстрат, содержавший тетрапептидную последовательность DEVD, растворяли в прилагаемом буфере и смешивали с цитозолем в отношении 1 : 1. Контролем служил буфер А, который использовали для гомогенизации листьев. Люминесцентные измерения проводили на универсальном анализаторе Victor ("Perkin Elmer", США) при температуре 22°С. Активность каспаз-3/7 выражали в относительных единицах люминесценции.
Содержание АТФ измеряли в супернатанте, полученном после осаждения белков из цитозольной фракции. Осаждение белков проводили центрифугированием при 7000 g 10 мин. Предварительно пробы прогревали при 98°С в течение 2 мин. Содержание АТФ определяли с помощью биолюминесцентного тест-набора Enliten ATP Assay System ("Promega"). Люминесценцию измеряли с помощью люминометра TD20/2 0 ("Turner BioSystems", США). Содержание АТФ рассчитывали с помощью калибровочной кривой (10-16-10-12 М).
Результаты представлены в виде средних арифметических значений и стандартных отклонений, полученных в 3-5 независимых экспериментах, каждый из которых проведен в 3-х кратной аналитической повторности.
РЕЗУЛБТАТЫ
Оксид азота подавляет И202-индуцированное перекисное окисление липидов в листьях табака
Известно, что ПОЛ является одним из первых последствий окислительного повреждения мембранных систем. Количество стабильного продукта этого процесса - МДА, свидетельствует о глубине ПОЛ и используется в качестве индикатора окислительного стресса [12]. Однако в литературе до сих пор не было данных о том, как NO
влияет на окислительныи стресс и, в частности, на ПОЛ, при их индукции таким универсальным окислителем, как Н2О2. Мы наблюдали максимальное содержание МДА после обработки листьев Н2О2 (20 м М) в течение 3 ч (данные не показаны). В этом случае содержание МДА увеличивалось в 2 раза (рис. 1). Такие условия обработки листьев Н2О2 использованы и в дальнейших исследованиях ПОЛ.
Было изучено влияние различных концентрации SNP (от 1 мкМ до 1 мМ) на образование МДА при окислительном стрессе. Из рис. 1 в идно, что при предварительной обработке листьев SNP (100 мкМ) в течение 24 ч количество МДА, образующегося при окислительном стрессе, индуцированном 20 мМ Н2О2, снижалось до уровня контроля, в качестве которого служили листья, обработанные водоИ. Следовательно, NO способен уменьшать последствия окислительного стресса, о чем свидетельствует снижение образования МДА.
В литературе имеются данные о том, что 2-(4-карбоксифенил)-4,5-дигидро-4,4,5,5-тетраметил-1Н-имидазол-1-илокси-3-оксид калия (cPTIO) является антагонистом NO и используется in vivo для ингибирования физиологических эффектов, опосредованных NO, в клетках растениИ [3]. Чтобы убедиться в наличии эффекта SNP на содержание МДА при окислительном стрессе, обусловленном
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.