ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 2, с. 133-141
= ГЕНЕТИКА =
УДК 577.24+612.017.12:577.214.5[616.894-053:616.831]
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНТИТЕЛ К ГЛУТАМАТУ НА ПОВЫШЕННУЮ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ПРОГРАММИРУЕМОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС, ВЫЗВАННОЙ ВВЕДЕНИЕМ Р-АМИЛОИДНОГО ФРАГМЕНТА (25-35)
© 2014 г. В. В. Колобов*, Т. В. Давыдова**, В. Г. Фомина**
*Научный центр неврологии РАМН, 125367Москва, Волоколамское ш., 80 **Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН,
125315 Москва, ул. Балтийская, 8 E-mail: f.neurochemistry@gmail.com Поступила в редакцию 01.10.2012 г.
Показано, что антитела к глутамату, интраназально введенные в дозе 300 мкг/кг крысам линии Wistar, снижали повышенные уровни экспрессии генов Aifm1, Casp3 и Parp1 в префронтальной коре и генов Aifm1 и Casp3 в гиппокампе на третьи сутки после введения Р-амилоидного фрагмента Лр25_35 в ядра Мейнерта головного мозга. Изменений экспрессии генов Aifm1, Casp3 и Parp1 в гипоталамусе, а также изменений экспрессии гена Bax во всех исследованных структурах мозга не выявлено. Обнаруженные особенности экспрессии генов в префронтальной коре и гиппокампе рассматриваются с позиций развития различных программ гибели клеток, которые модулируют антитела к глутамату.
DOI: 10.7868/S0002332914020039
Амилоидная гипотеза, основанная на индукции Р-амилоидом (АР) окислительного стресса, — наиболее разработанная среди молекулярно-ге-нетических гипотез, объясняющих механизмы развития болезни Альцгеймера (БА) (Hardy, Hig-gins, 1992). Современные представления о нейро-биологических механизмах БА — хронического нейродегенеративного заболевания пожилого и старческого возраста, характеризующегося церебральной атрофией и развитием деменции, — связывают с нарушением фолдинга белков, отложением фибриллярного Ар в виде сенильных бляшек и перерождением нейрофибрилл с образованием нейрофибриллярных клубков. Это приводит к развитию оксидативного стресса, эксайтотоксич-ности глутамата, иммунного воспаления, апопто-за и в конечном итоге к гибели нейронов и глии (Revett et al., 2013).
Ар способен блокировать синаптическую передачу, нарушать аксональный транспорт, изменять гиппокампальную долговременную потен-циацию и опосредовать нейрональную гибель (Walsh et al., 2002; Walsh, Selkoe, 2007; Benilova et al., 2012; Tang et al., 2012). В последнее время было показано, что введение фрагмента Ар25_35 в ядра Мейнерта обусловливает распространенные нейродегенеративные изменения нейронов во фронтальной коре и гиппокампе, приводящие к дефицитарным нарушениям когнитивных функций (Giovannelli еt al., 1995). Нейротоксичность
АР25-35 на морфологическом уровне подтверждена в литературе. Так, на фронтальных гистологических срезах мозга крыс обнаружено большое число хроматофильных и ацидофильных нейронов в неокортексе, гиппокампе, коре и базальных ядрах переднего мозга ^ерашсИеу гг а1, 2004). Главную роль в механизмах нейрональной гибели, ведущей к появлению когнитивных нарушений при БА, играет апоптоз (1еШ^ег, 81аёе1шапп, 2001; Ауак-Огс^о гг а1., 2002; Кегшег гг а1., 2004).
Известно, что на нарушения, происходящие в центральной нервной системе, иммунная система реагирует выработкой антител не только на высокомолекулярные, но и на низкомолекулярные вещества, в частности нейромедиаторы (Евсеев, 2007). В последнее время показано образование антител к глутамату (АТ-Глу) и установлено их защитное действие при нейропатическом болевом синдроме (Евсеев и др., 2008), эмоциональных стрессорных реакциях (Евсеев и др., 2010) и нарушениях памяти, вызванных введением в ядра Мейнерта Р-амилоидного фрагмента Ар25_35 (Горбатов и др., 2010). Вместе с тем механизмы протекторных эффектов АТ-Глу практически не исследованы.
Ранее на модели БА, вызванной введением нейротоксического фрагмента Ар25_35 в ядра Мейнерта, было обнаружено, что к третьим суткам эксперимента интраназальное введение АТ-Глу
препятствует развитию когнитивных нарушений и снижает активность каспазы-3, относительный уровень экспрессии гена Dffb, кодирующего ß-полипептид фрагментирующего ДНК фактора, ферментативная активность которого зависит от каспазы-3 при апоптозе (Колобов и др., 20126, 2012в, 2013).
Стремительное накопление молекулярно-биохимических данных привело к созданию биоинформационных баз данных, т.е. к интеграции знаний для построения сигнальных путей в клетках организмов как в норме, так и при патологии (Сорокина и др., 2013; Gruden et al., 2013). На портале неврологических заболеваний периодически обновляющейся базы данных Rat Genome Databases (http://rgd.mcw.edu/rgdCuration/) по состоянию на 21.09.2012 г. имеется 205 генов, вовлеченных в развитие патологических процессов при экспериментальном моделировании БА у крыс. Среди них отмечены гены таких проапоптотиче-ских соединений, как каспаза-3, Вс12-ассоцииро-ванный Х-белок (Bax), а также принимающий участие в репарации ДНК и регуляции клеточных воспалительных ответов при БА ядерный фермент поли(АДФ-рибозо)полимераза-1 (Kauppin-en et al., 2011).
Цель работы — изучение влияния интраназаль-но введенных АТ-Глу на экспрессию генов апо-птозиндуцирующего фактора (Aifm1), проапопто-тического белка Bax (Bax), каспазы-3 (Casp3) и фермента репарации поли(АДФ-рибозо)полиме-разы-1 (Parp1) в префронтальной коре, гипоталамусе и гиппокампе на третьи сутки после введения Aß25-35 в ядра Мейнерта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проведены на 35 самцах крыс линии Wistar массой 270—300 г, выращенных в виварии НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму ad libitum при 12-часовом световом режиме. При работе с крысами соблюдались требования к использованию животных для экспериментальных исследований, сформулированные Советом Европейского сообщества (Директива 2010/63/EU от 22.09.2010).
Крысы были разделены на семь групп (по пять животных в каждой группе):
интактные животные, которым в первые сутки эксперимента интраназально вводили 10 мкл дистиллированной воды (И + H2O);
интактные животные, которым интраназально вводили водный раствор АТ-Глу (300 мкг/кг) от иммунизированных кроликов (И + АТ-Глу);
ложнооперированные (ЛО) животные;
животные с двусторонним введением нейро-токсического фрагмента Р-амилоидного белка АР25-35, которым через 1 ч после операции вводили интраназально по 10 мкл дистиллированной воды (Ар25_35 + H2O);
животные, которым по той же схеме интраназально вводили водный раствор АТ-Глу от иммунизированных кроликов в дозе 300 мкг/кг (Ар25_35 + + АТ-Глу);
животные, которым по той же схеме интрана-зально вводили водный раствор кроличьего у-глобулина от интактных кроликов в дозе 300 мкг/кг (Ар25_35 + у-глобулин);
интактные животные (И).
АТ-Глу получали от кроликов, иммунизированных по стандартной схеме конъюгатом глута-мата с бычьим сывороточным альбумином, который синтезировали с использованием глутараль-дегида (Евсеев, 2007). Титр АТ-Глу, определяемый методом иммуноферментного анализа, составил 1 :1024.
у-глобулиновые фракции из сыворотки иммунизированных и интактных кроликов выделяли методом осаждения сульфатом аммония. АТ-Глу очищали от бычьего сывороточного альбумина методом аффинной хроматографии. Полученные препараты лиофилизировали и хранили при 4°C. Для интраназального введения животным готовили водный раствор АТ-Глу непосредственно перед началом эксперимента.
Моделирование БА проводили по известной и широко используемой методике посредством билатерального введения в ядра Мейнерта (n. basalis magnocellularis) 0.4 нмоль нейротоксического фрагмента белка Ар25_35 в 2 мкл водного раствора (Harkany et al., 1998). Операцию проводили на стандартной стереотаксической установке для крыс, в качестве наркоза применяли хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно. Раствор фрагмента Ар25_35 в мозг вводили с помощью микрошприца 7002N (Hamilton Bonaduz AG, Швейцария). Топографию ядер для проведения операции определяли по стереотаксическому атласу с координатами ядра Мейнерта АР -1.4, OL 2.7, H 8.7 (Paxinos, Watson, 2007). Использование Ар25_35 связано с тем, что, во-первых, у пациентов с БА наблюдается созревание именно этой формы Ар (Pike et al., 1995; Kubo et al., 2002) и, во-вторых, основоположник модели БА путем введения ней-ротоксина в передние ядра Мейнерта применял эту же форму Ар (Harkany et al., 1998).
На третьи сутки после введения Ар25_35 образцы префронтальной коры, гипоталамуса и гиппо-
Структура праймеров для ОТ-ПЦР в реальном времени
Ген, номер в GenBank Праймер Нуклеотидная последовательность Температура отжига праймеров, °С Место отжига праймера, экзон Длина продукта, пара оснований
Actb, NM_031144 Actb F 5'-GAA-GAT-CCT-GAC-CGA-GCG-TG-3' 60 3 327
Actb R 5'-AGC-ACT-GTG-TTG-GCA-TAG-AG-3' 4
Aifml, NM_031356 Aifm1 F 5'-TGG-GAT-TAG-GAC-TGT-CAC-CAG-3' 58 3 225
Aifm1 R 5' - GAG-GAG -GTC -GCA-TGT-ATG-GT-3' 5
Bax, NM_017059 Bax F 5'-GAG-CTG-CAG-AGG-ATG-ATT-GC-3' 61 3/4 194
Bax R 5'-CAG-CCC-ATG-ATG-GTT-CTG-AT-3' 5
Casp3, NM_012922 Casp3 F 5'-GAA-ACC-TCC-GTG-GAT-TCA-AA-3' 58 2 205
Casp3 R 5'-TAG-CTG-CAT-CGA-CAT-CGG-TA-3' 4
Parpl, NM_013063 Parp1 F 5'-AAA-GCA-GCC-AAT-GTT-CGA-GT-3' 58 10 187
Parp1 R 5'-CAC-CCT-TGC-TCT-TCT-TGG-AG-3' 10
кампа извлекали при 4°С, замораживали их в жидком азоте и хранили при —80°С. Данная временная точка была выбрана в связи с тем, что в этот период на используемой модели фиксируется максимальная активация сигнальных путей апоптоза в структурах головного мозга (Нагкапу гга1., 2000; Горбатов и др., 2010; Колобов и др., 2012б, в, 2013).
Тотальную фракцию РНК выделяли из структур мозга с помощью ТШ2о1 (1пуйго§еп, США) в соответствии с протоколом производителя и с использованием гомогенизатора DIAX 100 (Не1ёо1рИ, Германия) (режим: 5000 об./мин в течение 15 с). Полученные препараты РНК очищали от примесей геномной ДНК, обрабатывая ДНКазой I при 37°С в течение 30 мин с последующим прогреванием при 65° С в течение 10 мин для инактивации фермента (Ргоше§а, США). Концентрацию РНК определяли на флуориметре Qubit (1пуИго§еп).
Анализ экспрессии генов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.