РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2012, том 52, № 6, с. 602-607
-- УФ-ОБЛУЧЕНИЕ
УДК [57+61]::539.1.047:612:51.111.2:535-3
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ АУТОЛОГИЧНОЙ ПЛАЗМЫ ОТ РАЗВИТИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В УФ-ОБЛУЧЕННЫХ ЛИМФОЦИТАХ
КРОВИ ДОНОРОВ © 2012 г. О. В. Башарина1, О. В. Земченкова2, В. Г. Артюхов1 *
воронежский государственный университет 2Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко
Исследовано влияние УФ-света (240—390 нм) в дозах 151 и 755 Дж/м2 на интенсивность процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ), активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), сукцинатдегид-рогеназы (СДГ), цитохром с оксидазы (ЦО) и уровень энергообеспеченности лимфоцитов крови доноров в отсутствие и в присутствии аутологичной плазмы крови. Показано, что аутологичная плазма при инкубировании как нативных, так и фотомодифицированных лимфоцитов снижает интенсивность пероксидного окисления липидов, что приводит к защите клеток от развития окислительного стресса. При этом в УФ-облученных лимфоцитах восстанавливается (в течение суток) внутриклеточный уровень АТФ, что обусловливает повышение адаптационных возможностей клеток в присутствии аутологичной плазмы.
Лимфоциты, УФ-свет, АТФ, пероксидное окисление липидов, аутологичная плазма.
Для стимуляции в организме пролифератив-ных процессов (репаративной регенерации тканей, гемопоэза, иммуногенеза) современная медицина широко использует различные методы светолечения, в том числе и УФ-терапию [1]. Наряду с активацией пролиферации, излучения оптического диапазона обладают антивоспалительным, иммуномодулирующим и анальгетическим действиями, улучшают микроциркуляцию крови, нормализуют метаболические процессы [2]. Это вызывает незамедлительное изменение структурно-функциональных состояний клеток и компонентов плазмы всей циркулирующей крови [3], что, в свою очередь, ведет к коррекции многих показателей гомеостаза: в частности, значительно повышается ростостимулирующая активность плазмы крови [4]. Одним из широко распространенных методов терапии является аутотрансфу-зия УФ-облученной крови (АУФОК).
Ведущее место в лечебном эффекте АУФОК принадлежит перестройке иммунной системы организма. Объектами непосредственного воздействия УФ-света являются все компоненты крови, в том числе иммунокомпетентные клетки и гуморальные факторы иммунитета. УФ-облуче-ние клеток приводит к протеканию в них одновременно нескольких фотохимических реакций: фотоинактивации белков в результате фотолиза ароматических аминокислот и серосодержащих
* Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, ВГУ; тел.: (473) 220-89-81, (473) 220-85-86; факс: (473) 220-83-08; e-mail: avg@main.vsu.ru.
групп, пероксидному окислению липидов мембран, фотодеструкции различных коферментов, таких как пиридиннуклеотиды, флавины, кофер-мент р, геминовые соединения, которые связаны с ферментными системами, встроенными в биомембраны. Фотохимические реакции с участием любого из этих хромофоров должны отразиться на функционировании мембраны и клетки в целом.
Облученная кровь при возвращении в кровяное русло активирует массу циркулирующих лимфоцитов. Естественно, что изменения функционирования иммуноцитов не могут не иметь метаболической основы. Применение УФ-света как модулятора функциональной активности лимфоцитов ведет к изменению метаболизма клеток, переключая субстратные потоки с одного метаболического пути на другой, влияя на энергетические и синтетические процессы в них. В качестве источников энергии лимфоциты в основном используют глюкозу и глутамин, в меньшей степени — кетоновые тела и жирные кислоты [5]. Ключевую роль в энергетическом обеспечении клеточного роста, активации и продукции цито-кинов играет глюкоза [6]. Интерес к изучению внутриклеточного метаболизма лимфоцитов объясняется, с одной стороны, филогенетически закрепленной способностью лимфоцитов быстро реагировать на любые изменения гомеостаза, с другой — тем, что изменения активности ферментов лимфоцитов проявляются значительно раньше, чем количественные изменения в лейкоцитарной формуле.
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ АУТОЛОГИЧНОЙ ПЛАЗМЫ
603
В данной работе мы исследовали интенсивность процессов пероксидного окисления липи-дов (ПОЛ), изменение активности ферментов катаболизма глюкозы, ответственных за энергообеспечение лимфоцитов крови человека, а также возможное защитное действие аутологичной плазмы от развития окислительного стресса в лимфоцитах, модифицированных воздействием УФ-света в терапевтическом диапазоне доз, применяемых при АУФОК-терапии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов из периферической гепаринизированной крови здоровых доноров осуществляли путем ее центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (р = = 1.077 г/см3).
УФ-облучение лимфоцитов (2 х 106 клеток/мл) проводили при их непрерывном перемешивании магнитной мешалкой в термостатируемой кювете (20 ± 1°С) полусферической формы с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через све-тофильр УФС-1 с полосой пропускания 240— 390 нм (со спектральными линиями 253.7, 265.2, 280.0, 296.7, 302.2, 312.6 и 365.0 нм). Расстояние от оси лампы до кюветы с суспензией клеток составляло 0.23 м. Клетки облучали непосредственно после их выделения (и приблизительно через 1 ч после забора крови). Интенсивность облучения составляла 151 Дж/(м2 • мин). Объем вносимого в кювету образца — 2 мл. Использовали дозы 151 и 755 Дж/м2 при времени облучения соответственно 1 и 5 мин. Плотность энергии излучения, создаваемую УФ-лучами, измеряли с помощью уфиметра, смонтированного на кафедре биофизики Воронежского государственного университета. В качестве теплового приемника УФ-излу-чения в уфиметре применяли термобатарею, собранную из 50 нихромово-константановых термопар.
Лимфоциты инкубировали в течение суток в питательной среде RPMI-1640 ("Биолот", Россия) в отсутствие и с добавлением 18%-ной аутологичной плазмы крови или ферментов-анти-оксидантов (СОД (2 х 10-7 моль/л) и каталазы (10-6 моль/л) ) и с циклогексимидом (10-4 моль/л) при температуре 37°С в атмосфере с [СО2] = 5%. Для определения активности ферментов клетки лизировали путем гипоосмотического шока. Митохондрии выделяли общепринятым способом [7], в них определяли активность сукцинатдегид-рогеназы (СДГ) и цитохром с оксидазы [8]. Надо-садочную жидкость использовали для определения активности цитоплазматического фермента — лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [9]. Измерения проводили на спектрофотометре "$Ытаё2и RF-5301 РС". Концентрацию АТФ определяли с помощью люциферазной биолюминесцентной ре-
акции с использованием стандартного набора реагентов ("Люмтек", Россия). Об интенсивности процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) судили по уровню спонтанной (нестиму-лированной) люминол-зависимой хемилюми-несценции [10], регистрацию проводили в течение 500 с на биохемилюминометре БХЛ-06М, оценивали максимальную интенсивность и све-тосумму хемилюминесценции. Обработку результатов исследований проводили с помощью пакета статистических программ $1а1А511са 6.0. Достоверность различий сравниваемых средних значений оценивали при помощи ¿-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0.05. Предположение о нормальности распределения проверялось с помощью х2-критерия согласия Пирсона, а равенство дисперсий в двух группах было оценено с помощью /-критерия Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выявлено, что непосредственно после УФ-об-лучения суспензии лимфоцитов происходит повышение уровня ПОЛ (рис. 1). В ходе суточной инкубации нативных лимфоцитов в отсутствие плазмы наблюдается незначительное повышение светосуммы хемилюминесценции (рис. 1). В то же время при 24-часовой инкубации как натив-ных, так и фотомодифицированных лимфоцитов в присутствии аутологичной плазмы происходит статистически значимое снижение светосуммы хемилюминесценции (рис. 1). Кроме того, при инкубации УФ-облученных в дозе 151 Дж/м2 клеток с плазмой уровень ПОЛ не отличается от значений, характерных для лимфоцитов непосредственно после их выделения из крови. Таким образом, плазма проявляет такие же антиокси-дантные свойства, как и внесение в суспензию клеток в физиологических концентрациях ферментов антиоксидантной защиты — супероксид-дисмутазы и каталазы (рис. 1). Антиоксидантные свойства плазмы обусловлены тем, что помимо ферментативной антиоксидантной защиты (АОЗ) в ней имеется мощная система неферментативной АОЗ, включающая аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин, белки: трансфер-рин и церулоплазмин, которые связывают металлы переменной валентности, препятствуя их вступлению в реакцию Габера—Вейса. В работе [11] указывается, что добавление плазмы в реакционную смесь приводило к увеличению латентного периода фотохемилюминесценции люми-нола.
Ранее нами было показано [12], что непосредственно после УФ-облучения суспензии лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/м2 происходит снижение активности ЛДГ, СДГ и ЦО. Это приводит к снижению интенсивности как аэробного, так и
604
БАШАРИНА и др.
мВ • с
12000 г
10000
□ 2 Н 3 Ш 4
= Э5
8000
6000
4000
2000
151
Доза облучения, Дж/м2
Рис. 1. Влияние УФ-света на светосумму хемилюминесценции: 1 — лимфоциты непосредственно после выделения; 2, 3 — лимфоциты после 24-часовой инкубации в отсутствие и присутствии плазмы соответственно; 4, 5 — лимфоциты, инкубируемые в присутствии СОД (4) и каталазы (5).
[АТФ], пкмоль/л 130
110
90 -
70 -
50
4
Время инкубации клеток, ч
24
0
0
Рис. 2. Изменение концентрации АТФ в ходе суточной инкубации лимфоцитов: 1 — нативные лимфоциты; 2, 3 — фо-томодифицированные в дозах 151 и 755 Дж/м2 лимфоциты, инкубируемые в отсутствие и присутствии аутологичной плазмы соответственно.
Рис. 3. Изменение активности ЛДГ (а), СДГ (б) и ЦО (в) в ходе суточной инкубации лимфоцитов: 1 — начальная активность; 2, 3 — активность через 24 ч в отсутствие и присутствии плазмы соответственно; 4 — активность через 24 ч в присутствии циклогексимида.
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ аутологичнои плазмы
605
А, ммоль/л ■ мин 0.7 г
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0
А, мкмоль/л ■ мин 9
^ I
0
А, мкмоль/л • мин 2.1 г
1.8 1.5 1.2
0.9
0.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.