ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 44, № 1, с. 44-48
УДК 577.112:579.861.043:535.31
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВОГО ЭКЗОМЕТАБОЛИТА Luteococcus japonicus subsp. casei НА КЛЕТКИ, ПОДВЕРГНУТЫЕ НАГРЕВАНИЮ И УФ-ОБЛУЧЕНИЮ
© 2008 г. Л. И. Воробьёва, Е. Ю. Ходжаев, Г. М. Пономарёва
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899;
e-mail: nvvorobjeva@mail.ru Поступила в редакцию 16.08.2006 г.
Белковый экзометаболит, выделенный из культуральной жидкости Luteococcus japonicus subsp. casei, оказывал реактивирующее и протекторное действие на УФ-облученные и нагретые клетки. Экзометаболит образовывался клетками в логарифмической фазе роста и содержался в культуральной жидкости в ничтожных количествах. На основании масс-спектрального анализа показано, что наряду с главным компонентом с молекулярной массой 7.6 кДа, в препарате в незначительных количествах присутствовали 3 минорных белка. Вероятно, биологическая активность экзометабо-лита связана с участием главного полипептидного компонента.
Способность микроорганизмов выживать в неблагоприятных условиях связана с работой ин-дуцибельных адаптационных механизмов.
Классические индукционные механизмы хорошо изучены. Они включают участие внутриклеточных сенсоров и сигнальных молекул, активирующих экспрессию соответствующих белков.
В последние годы показано, что большая часть стрессовых ответов бактерий индуцируется механизмами, включающими внеклеточные компоненты [1-3], которые могут быть представлены белковыми молекулами, а также небелковыми соединениями (некоторые аминокислоты, экзополисаха-риды, эктоин, бетаин и др.). Показано [4], что внеклеточные факторы адаптации Escherichia coli образуются в процессе роста культуры в обычных условиях, легко диффундируют в окружении бактерий и могут служить сигналом, предупреждающим клетки, находящиеся по "соседству", об угрозе жизни. Под действием стресса сигнальные молекулы, образованные клетками E. coli, претерпевают изменения, превращаясь в индукторы устойчивости к стрессу.
В культуре E. coli [4], Bacillus subtilus [5], Pseudomonas fluorescens [6] обнаружены экзометабо-литы протекторного типа. Протекторы могут непосредственно взаимодействовать со структурами клеток или нейтрализовать активные молекулы [7].
В случае летальных доз стрессоров, когда число выживших, но неделящихся клеток составляет сотые или даже тысячные доли процента, их активирование и деление может быть индуцировано при участии внеклеточного реактивирующего фактора (РФ), впервые обнаруженного у представителя семейства Propionibacteriaceae - Luteococcus
japonicus subsp. casei [3]. Было показано,что растущая культура L. casei выделяет в среду метаболит белковой природы, оказывающий реактивирующее действие на клетки продуцента, подвергнутые УФ-облучению, нагреванию и окислительному стрессу [3, 8].
Цель работы - изучение протекторного действия указанного экзометаболита на клетки L. casei, подвергнутые стрессорным воздействиям.
МЕТОДИКА
Выращивание бактерий и получение источников внеклеточных протекторов. Объектом для стрессорных воздействий служили клетки L. casei, выделенные из сыра и описанные ранее [9]. Выращивание L. casei проводили в стационарных условиях при 30°С на глюкозо-минеральной среде следующего состава (%): глюкоза - 1.5, (NH4)2SO4 -0.3, КН2Р04 - 0.1, Na2HPO4 - 0.2, Caa2 - 0.002, MgSO4 - 0.002, №С1 - 0.002, СоС12 ■ 6Н20 - 0. 0001, триптон ('та^о", США) - 0.1, дрожжевой экстракт ("БИЪо", США) - 0.05, дистиллированная вода, рН 7.0.
Кислоты, образованные в процессе роста бактерий, периодически нейтрализовали 5%-ным раствором №ОН.
Клетки бактерий отделяли от среды центрифугированием (6000 g, 20 мин), промывали 0.05 М ^-фосфатным буфером (рН 7.4) и суспендировали в том же буфере. Полученные суспензии служили объектом для стрессорных воздействий. Су-пернатант L. casei, называемый культуральной жидкостью (КЖ), использовали как источник РФ и протекторных и реактивирующих факторов.
Таблица 1. Защитное действие белкового экзометаболита (РФ) Ь. салв1 иа клетки той же культуры, подвергаемые нагреванию
Условия эксперимента Среднее число клеток, х105 мл 1 Выживаемость, % Индекс деления
Интактные клетки, инкубированные
с №0 (3%) 170 ± 5.1 100 -
с №01 и с последующим прогреванием 0.057 ± 0.005 0.034 1.0
(53°С, 25 мин)
с РФ и последующим прогреванием 0.300 ± 0.024 0.180 5.3
Интактные клетки, предынкубированные 0.039 ± 0.002 0.023 1.0
с протеиназой К с последующим
прогреванием
Инкубированные с РФ, обработанным 0.057 ± 0.004 0.034 1.5
протеиназой К и последующим прогрева-
нием
Интактные клетки, предынкубированные 0.057 ± 0.002 0.034 1.0
с ДНКазой с последующим прогреванием
Инкубированные с РФ, обработанным 0.30 ± 0.020 0.180 5.3
ДНКазой, с последующим прогреванием
Интактные клетки, предынкубированные 0.06 ± 0.004 0.035 1.0
с РНКазой с последующим прогреванием
Инкубированные с РФ, обработанным 0.33 ± 0.003 0.190 5.5
РНКазой, с последующим прогреванием
Реактивирующая активность была локализована в белковом экзометаболите - РФ, выделение которого проводили, как описано ранее [3].
Стрессорные факторы. Использовали УФ-об-лучение и нагревание при 53°С. При изучении стрессорных воздействий проводили предварительные эксперименты для установления зависимости "доза - ответ". Источником УФ-облучения служила установка из двух параллельно смонтированных ламп БУВ-15 (Россия) мощностью 30 Вт, главная эмиссия которых приходилась на область 253.7 нм. Для определения выживаемости проводили десятикратные разведения контрольной (не подвергаемой стрессорным воздействиям) и опытной (подвергаемой облучению или нагреванию) суспензий бактерий с последующим их высевом на плотные среды. Бактерии на чашках Петри инкубировали в течение 72 ч при 30°С.
Определение протекторной и реактивирующей активности. Для определения активности суспензию клеток до (протекция) или после (реактивация) стрессорного воздействия инкубировали с КЖ или РФ. Использовали микрометод, при котором в одну чашку с агаризованной питательной средой вносили 6 проб по 5 мкл суспензии в каждой. Реактивирующий эффект оценивали путем сравнения числа колоний, вырастающих из клеток опытного и контрольного варианта. Выживаемость микроорганизмов выражали в процентах по отношению к контролю и определяли индекс деления, как число клеток, образующих колонии после инкубирования с РФ или с КЖ, к числу коло-
ний, вырастающих из клеток без пред- или по-стынкубации.
Обработку РФ (1 мл) протеиназой К (0.05 мл суспензии, содержащей иммобилизованный на бусах фермент фирмы "Gelman", США) проводили при инкубации (1 ч, 37°С) в среде, содержащей 0.01 М трис, 0.005 М ЭДТА, рН 7.8. Инкубация с ДНКазой (4 мкг/мл) и РНКазой (20 мкг/мл) проходила в следующей среде: 0.01 М фосфатный буфер и 0.001 М MgSO4, рН 7.0.
Масс-спектрометрия. Масс-спектр белкового препарата снимали на приборе Autoflex II ("Bruker Daltonics", Германия). Для ионизации образцов использовали азотный лазер (337 нм). В качестве матрицы применяли а-циано-я-гидроксикоричную и синапиновую кислоты.
Статистическая обработка. В таблицах приведены средние арифметические величины из 3 независимых экспериментов и их стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Данные, представленные в табл. 1, показывают, что выживаемость суспензии клеток Ь. са8в1, предынкубированных с РФ с последующим нагреванием, увеличивалась более, чем в 5 раз, по сравнению с контрольными клетками. В результате предобработки РФ протеиназой К его защитное действие снижалось более, чем на 70%. ДНКаза и РНКаза не оказывали инактивирующего действия на РФ. КЖ, освобожденная от РФ, также проявля-
46 ВОРОБЬЕВА и др.
Таблица 2. Защитное действие экзометаболитов иной, чем РФ природы, на подвергнутые нагреванию клетки Ь. casвi
Условия эксперимента Среднее число клеток, х105 мл 1 Выживаемость, %
Интактные клетки, инкубированные:
в синтетической среде 90.00 ± 0.4 100
в синтетической среде с последующим 0.27 ± 0.015 0.30
прогреванием
с КЖ, лишенной РФ (КЖ*), затем нагре- 0.51 ± 0.021 0.57
тые
с КЖ*, предынкубированной с протеина- 0.45 ± 0.054 0.51
зой К, затем нагретые
с КЖ*, предынкубированной с ДНКазой, 0.54 ± 0.020 0.53
затем нагретые
с КЖ*, предынкубированной с РНКазой, 0.58 ± 0.020 0.57
затем нагретые
Индекс деления
Таблица 3. Влияние обработки РФ на его защитное и реактивирующее действие
Условия эксперимента Среднее число клеток, х106 мл 1 Выживаемость, % Индекс деления
Интактные клетки, инкубированные:
с NaCl (3%) 150 ± 7.1 100 -
с NaCl, затем облученные 0.09 ± 0.008 0.06 1.0
с РФ, затем облученные 0.26 ± 0.012 0.17 2.9
с РФ1, затем облученные 0.26 ± 0.014 0.17 2.9
с РФ2, затем облученные 0.26 ± 0.015 0.17 2.9
Облученные клетки, затем инкубированные c NaCl 0.13 ± 0.012 0.09 1.0
Облученные клетки, затем инкубированные с РФ 0.48 ± 0.061 0.32 3.7
с РФ1 0.50 ± 0.058 0.33 3.8
с РФ2 0.46 ± 0.052 0.31 3.5
Примечание. РФ1 - предварительно облучен УФ-светом (доза - 146 Дж/м2), РФ2 - предварительно нагрет (50°С, 30 мин). Доза облучения суспензии Ь. casвi в этих и последующих экспериментах 133 Дж/м2.
ла защитное действие, которое не снималось при ее обработке протеиназой К, ДНКазой и РНКазой (табл. 2). Таким образом действие КЖ обусловлено присутствием как белкового, так и небелкового компонента (компонентов), при этом вклад РФ был значительно выше.
Защитное действие РФ в случае УФ-облучен-ных клеток (табл. 3) проявлялось почти в 2 раза слабее, чем у клеток, подвергаемых нагреванию (табл. 1).
Главной мишенью УФ-облучения, термального, кислотного и щелочного стресса служит ДНК [10], повреждения которой активируют гесА-ген и вызывают индукцию SOS-ответа. Ответ клеток на термальный стресс, как известно, связан также с образованием белков хит-шока, и различие в степени защитного действия РФ в случае УФ-облучен-
ных и инактивированных при нагревании клеток может быть связано с двойным эффектом РФ в последнем случае: при действии температурного стресса РФ может индуцировать синтез ферментов репа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.