ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 6, с. 617-623
УДК 577.112:579.861.043:535.31
ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ РЕАКТИВИРУЮЩЕГО ФАКТОРА Luteococcus japonicus subsp. casei НА ИНАКТИВИРОВАННЫЕ УФ-СВЕТОМ КЛЕТКИ РЕПАРАЦИОННЫХ МУТАНТОВ Escherichia coli
© 2010 г. Л. И. Воробьёва, А. В. Федотова, Е. Ю. Ходжаев
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899
e-mail: nvvorobjeva@mail.ru Поступила в редакцию 23.12.2009 г.
Реактивирующий фактор (РФ) из Luteococcus japonicus subsp. casei оказывал протекторное действие на облученные УФ клетки Escherichia coli AB 1157 с неповрежденной системой репарации и на клетки изогенных репарационных мутантов E. coli UvrA-, RecA- и PolA-, которое проявлялось в многократном увеличении выживаемости. Защитное действие экзометаболита L. casei не связано со стимуляцией репарационных систем E. coli и, по-видимому, обусловлено вовлечением его в механизм деления клеток. РФ не вызывал реактивацию инактивированных УФ-светом клеток E. coli.
Микроорганизмы различных эколого-физиоло-гических групп образуют внеклеточные факторы адаптации (ВФА), которые защищают организмы от привычных и "незапланированных" стрессов. Выделяют следующие типы ВФА: стабилизаторы клеточных структур (мембран и макромолекул); регуляторы адгезии клеток; соединения нейтрализующего действия; сигнальные индукторы защитных и реактивирующих механизмов клетки [1].
Стабилизирующее действие показано для химических аналогов фактора d1 — алкилоксибензолов [2]. Их предынкубация in vitro с подвергнутыми стрессовым воздействиям клетками приводила к повышению стабильности и модуляции активности ферментов [3]. Механизм действия алкилоксибензолов на клетки может включать их функционирование как шаперонов [2].
При попадании в новые условия существования происходит прилипание бактериальных клеток к твердой поверхности как проявление так называемого "стресса новой среды" [4]. Обратимая адгезия опосредуется внеклеточными адгезинами и антиад-гезинами, химическая природа которых установлена у Pseudomonas fluorescens [4, 5].
К антистрессовым факторам нейтрализующего действия относят дисмутагены бактерий, фактор хх небелковой природы у E. coli и P. fluorescens [6—8].
В группу ВФА сигнального действия включают небольшие белки, индуцирующие устойчивость клеток E. coli к высокой кислотности [9], щелочности [10], температуре [11], УФ-облучению [12]; фактор хп [8]; реактивирующий фактор (РФ) Luteococcus japonicus subsp. casei [13—16].
ВФА могут обладать плейотропным действием, что показано для фактора d1, присутствующего у
многих микроорганизмов [2]. Штаммы могут продуцировать более одного фактора адаптации [8].
Образование адгезинов и антиадгезинов, соединений, стабилизирующих макромолекулы или обезвреживающих токсичные соединения, может быть особенностью определенных штаммов.
Индукция устойчивости клеток к неблагоприятным факторам среды с участием внеклеточных пептидных соединений широко распространена в мире микроорганизмов среди про- и эукариот и на уровне генов связана с функционированием двухкомпо-нентных регуляторных систем [17]. Механизм действия сенсорных молекул в общем виде описывают следующим образом: стимул, роль которого играет повреждение молекулы ДНК или изменение внешней среды, воспринимается внеклеточным сенсором или сенсорным рецепторным белком, встроенным в цитоплазматическую мембрану или находящимся в цитозоле [17]. Воздействие стимула на сенсор вызывает конформационный или химический сигнал, который непосредственно или через белки-переносчики, поступает на регулятор транскрипции. Регулятор воздействует на первичную мишень-оперон, изменяя уровень экспрессии генов. Первичная мишень может контролировать одну или несколько вторичных мишеней. Белковые продукты экспрессии мишеней индуцируют стрессовый ответ. Наблюдаемым результатом каскадных реакций является индукция устойчивости клеток к стрессорному фактору (протекция) и восстановление деления инактивированных клеток (реактивация). Но что служит конкретной мишенью гена-регулятора, пока остается неясным.
Внеклеточный сенсор способствует быстрому индукционному ответу. Этот тип ответа не требует прохождения сенсора в клетку. Сенсор взаимодействует с организмом во время или даже до стресса, и
при этом сенсорная молекула действует как внеклеточный коммуникатор, предупреждающий соседние клетки о возможной угрозе жизни. Полагают, что участие ВФА в индукции может быть не ограничено условиями стрессов и имеет большое влияние на физиологию бактерий. Но пока эта область знаний заполнена отдельными работами, проводимыми лишь в немногих лабораториях.
Стрессы высокой интенсивности вызывают SOS-ответ или RpoS-ответ, непосредственно связанные с изменением состояния информационных систем, в первую очередь репликационных, транскрипционных и трансляционных.
Ранее было показано, что L. casei образует белковый экзометаболит с м.м. 7.6 кДа, при участии которого осуществляется не только протекция стрессиру-емых клеток бактерий и дрожжей, но также их реактивация после стрессов [13, 14, 16]. Экзометаболит L. casei был обозначен авторами как РФ. Некоторые свойства и особенности поведения РФ позволяют рассматривать его как сенсорную сигнальную молекулу [15, 16]. Устойчивая к стрессам молекула образуется и действует в ничтожных количествах в течение нескольких минут. Активность РФ зависит от состояния цитоплазматической мембраны.
Каков механизм антистрессового действия РФ? Связан ли он со стимуляцией работы репарационных систем клетки, или включаются иные системы стрессоустойчивости и восстановления жизнеспособности организма? Чтобы ответить на поставленные вопросы, были использованы изогенные штаммы E. coli с различными дефектами репарационных систем, Uvr A-, Rec A-, Pol A- и дикий тип AB 1157.
Цель работы — расшифровка механизма протекторного и реактивирующего действия РФ с использованием репарационных мутантов E. coli.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. Источником для выделения РФ служила культура L. casei. В качестве тест-объектов при изучении защитных и реактивирующих свойств экзометаболитов L. casei использовали следующие штаммы E. coli: AB 1157 (дикий тип), P-3478 (PolA-), AB 1886 Г (UvrA-), AB 2463 Г (RecA-), полученные из коллекции Института микробиологии и эпидемиологии РАМН им. Н.Ф. Гамалеи.
Штамм PolA- имел блок быстрой репарации ДНК и эксцизионной репарации короткими фрагментами, который обусловлен отсутствием ДНК-полимеразы I. Мутант осуществляет эксцизионную репарацию, хотя и более медленно, чем дикий тип. Остающиеся открытыми бреши эквивалентны не-вырезанным пиримидиновым димерам, вызывающим SOS-индукционный сигнал.
У штамма UvrA- отсутствовало эксцизионная система репарации. Штамм RecA- не осуществлял рекомбинационную и SOS-репарацию и сохраняет активность эксцизионной системы репарации.
У штамма AB 1157 системы репарации ДНК не нарушены.
Получение реактивирующего фактора. Выращивание бактерий L. casei проводилось в течение 48 ч при 32°С в 100 мл глюкозо-минеральной среды следующего состава (г/л): глюкоза - 1.5, (NH4)2SO4 -0.3, KH2PO4 - 0.1, Na2HPO4 - 0.2, CaCl2 - 0.002, MgSO4 - 0.002, NaCl - 0.002, CoCl2 • 6H2O - 0. 0001, триптон ("Difco", США) - 0.1, дрожжевой экстракт ("Difco", США) - 0.05, дистиллированная вода, рН 7.0. Кислоты, образованные в процессе роста бактерий, периодически нейтрализовали 5%-ным раствором NaOH. Клетки выросшей культуры отделяли центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин). Культуральную жидкость (КЖ) пропускали через нитроцеллюлозный мембранный фильтр ("Milli-pore", США), диаметр пор 0.22 мкм и адсорбированные на нем белки элюировали 3%-ным раствором NaCl с последующим пропусканием раствора через мембранный фильтр Acrodisc с низким сродством к белку ("Pall", США) для полного удаления клеток. Полученный раствор белка, обозначаемый как РФ, использовали в качестве антистрессового фактора. Для активации РФ проводили его облучение УФ-светом в течение 90 с.
Приготовление суспензии тест-культуры E. coli.
Культуру исследуемого штамма E. coli засевали в полноценную среду - питательный бульон ("Hime-dia", Индия), который разливали по 50 мл в кача-лочные колбы. Клетки культивировали на качалке (200 об/мин) при 37°С в течение ночи, отделяли от среды центрифугированием (5000 g, 15 мин), ресус-пендировали в 0.05 М Na-фосфатном буфере (рН 7.2) и вновь центрифугировали в тех же условиях. Полученный осадок разводили в том же буфере до оптической плотности 0.2-0.3 при длине волны 540 нм. Полученная суспензия служила объектом для стрессорных воздействий.
Приготовление суспензии тест-культуры L. casei. Выращивание бактерий проводилось в течение 24 ч при 32°С в 100 мл глюкозо-минеральной среды (состав см. выше). Клетки отделяли и отмывали от среды центрифугированием (5000 g, 15 мин), затем ресус-пендировали в 0.05 М Na-фосфатном буфере (рН 7.2) и повторно центрифугировали. Далее клетки разводили в том же буфере до оптической плотности 0.7-0.8.
Определение протекторной и реактивирующей активности экзометаболита. Для определения защитного и реактивирующего эффекта использовали микрометод.
Суспензию клеток в количестве 5 мл наливали в плоские стеклянные чашки Петри (диаметр 10 см) и
Таблица 1. Зависимость эффективности действия РФ от времени выращивания клеток продуцента Ь. еа8в1
Условия эксперимента Число жизнеспособных клеток х 105, КОЕ/мл Выживаемость, % ИД ИД/ОП
Интактные клетки Ь. еа$в1 760.0 ± 32.1 100 - -
Облученные клетки, затем инкубированные с:
буфером 0.040 ± 0.006 0.0053 1.00 -
РФ (время роста — 18 ч) 0.100 ± 0.021 0.0132 2.49 3.83
РФ (время роста — 24 ч) 0.112 ± 0.028 0.0148 2.79 3.77
РФ (время роста — 42 ч) 0.116 ± 0.016 0.0153 2.89 3.52
подвергали облучению УФ-светом в течение определенного времени в зависимости от цели эксперимента. Затем проводили ее постинкубацию в объемном соотношении 1 : 1 с буфером (контроль) и с РФ (опытный образец) в течение 15 мин при 37°С.
Для определения защитного эффекта суспензию клеток предварительно инкубировали с буфером (контроль) и с РФ (опытный образец) в течение 10 мин пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.