ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2010, № 4, с. 462-467
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.115.3:612.115.064
ЗАЩИТНЫЕ ПРОТИВОТРОМБОТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ ПРИ СТРЕССОГЕННЫХ
ВОЗДЕЙСТВИЯХ НА ОРГАНИЗМ ЖИВОТНЫХ © 2010 г. Л. А. Ляпина*, М. Е. Григорьева*, Л. А. Андреева**, Н. Ф. Мясоедов**
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, корп. 12 **Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. акад. Курчатова, 2
E-mail: lyapinal@mail.ru Поступила в редакцию 26.11.2009 г.
Установлено, что простейшие пролинсодержащие пептиды Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Gly-Pro и семакс оказывают защитное антистрессорное действие в организме, проявляющееся в активации противо-свертывающей системы. Интраназальное многократное введение каждого из этих пептидов крысам перед острым иммобилизационным стрессом препятствовало гиперкоагуляции, развивающейся в ответ на длительный стресс продолжительностью 60 мин. При этом в кровотоке крыс отмечалось усиление антитромбоцитарной, антикоагулянтной, фибрин-деполимеризационной и нормализация ферментативной фибринолитической активности. Наибольший антистрессорный эффект обнаруживался у дипептидов. Показано, что препарат семакс оказывал защитное действие от повышенной свертываемости крови, возникающей в условиях многократного иммобилизационного стресса.
Многие регуляторные пептиды обладают широким спектром биологической активности и играют ключевую роль в поддержании нормального гомеостаза при стрессе (Ашмарин и др., 2007). Пептиды, названные глипролинами, образуются в организме в результате внутри- и экстраклеточного катаболизма коллагена, эластина и родственных белков, а также в процессе протеолити-ческого расщепления белков, поступающих с пищей (Ашмарин и др., 2002). Установлено защитное антистрессорное действие относительно устойчивых к протеолизу пептидов глипролинового ряда Pro-Gly-Pro (PGP), Gly-Pro-Gly-Pro (Samonina etal., 2002; Смирнова, 2004; Мартынова, 2008). Ноотропный и нейропротективный пептид семакс, представляющий собой фрагмент АКТГ4-10 — АКТГ4-7, проявляет антигипоксический эффект (Ашмарин и др., 2002).
При развитии адаптивных реакций организма в зависимости от продолжительности и силы стрессора может наблюдаться или активация, или угнетение отдельных звеньев гемостаза (Samson etal., 2007; Furay et al., 2008). При непродолжительном (не более 30 мин) иммобилизационном стрессе установлена активация функции проти-восвертывающей системы (ПСС) и возникновение в крови агентов неферментативного фибри-нолиза (Kudrjashov, Lyapina, 1986), к каковым относятся и глипролины (Ашмарин и др., 1997; Ляпина и др., 2006). В условиях же продолжительного стресса (например, при иммобилизацион-
ном стрессе длительностью 60—90 мин) активируется тромбоцитарное звено гемостаза и угнетаются фибринолитическая и антикоагулянтная активность крови, что может привести к тромбо-филии (Spiezia etal., 2008).
Основываясь на том, что пролинсодержащие пептиды оказывают антикоагулянтно-фибрино-литическое действие при повышенной свертываемости крови в организме (Ляпина и др., 2006; Ашмарин и др., 2007), можно предположить, что в условиях гиперкоагуляции при иммобилизаци-онном стрессе они будут оказывать противосвер-тывающее действие вследствие их способности активировать функцию ПСС. Исследование влияния регуляторных пептидов на систему гемостаза при стрессогенных воздействиях позволит по-новому оценить участие глипролинов в сохранении адаптационных возможностей организма при различных патологических состояниях.
Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния пролин- и глицинсодержащих пептидов Pro-Gly (PG), Gly-Pro (GP), PGP и препарата семакс на плазменное и тромбоцитарное звенья гемостаза в условиях острого и многократного иммобилизационного стресса в эксперименте на животных и проведении сравнительного анализа антистрессорного действия исследуемых пептидов. Поскольку наиболее оптимальной дозой пептидов для проявления противосвертывающих эффектов установлена доза 1 мг/кг (Ляпина и др.,
2006), то в экспериментах на животных использовалась именно эта доза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах применяли пептиды PG, GP, PGP, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН, и отечественный коммерческий препарат пептида Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс).
В опытах in vivo использовано 175 лабораторных белых крыс-самцов с массой тела 200—250 г (в возрасте 8—9 мес.), содержащихся на обычном лабораторном рационе. Эксперименты на животных включали 3 серии. В первой серии на здоровых крысах выявляли антитромбоцитарное, анти-коагулянтное и фибринолитическое действие пептидов PG, GP, PGP и препарата семакс, для чего животным интраназально вводили по 0.05 мл каждого из пептидов в дозе 1 мг/кг массы тела (опытные группы) или 0.85%-ного физиологического раствора (контрольная группа) через каждые 24 ч в течение 4 сут. Во второй серии экспериментов на животных исследовали антистрессорное действие пептидов, для чего сначала 4 опытным группам животных вводили интраназально пептиды, как описано в первой серии эксперимента, а затем через 1 ч после последнего введения пептидов животных подвергали острому иммобили-зационному стрессу в течение 60 мин. В третьей серии экспериментов исследовали антистрессор-ное действие семакса в условиях многократного иммобилизационного стресса, для чего крысам, как описано во второй серии эксперимента, сначала вводили интраназально пептид семакс (или физиологическеий раствор), а затем через 1 ч после каждого введения ежесуточно животных подвергали иммобилизационному стрессу продолжительностью 60 мин. Иммобилизационный стресс у животных вызывали путем привязывания крыс к столику и выдерживания их в неподвижном состоянии в течение 60 мин.
Кровь на анализы брали в первой серии экспериментов через 1 ч после последнего 4-го введения пептидов, а во второй и третьей сериях — через 1 ч после проведения последней иммобилизации животных на фоне пептидов (опытные группы) или физиологического раствора (контрольная группа). Взятие крови у животных на анализы параметров гемостаза осуществляли шприцем из v. jugularis с использованием в качестве консерванта 3.8%-ного раствора лимоннокислого натрия в соотношении кровь : консервант как 9 : 1.
В плазме крови определяли показатели анти-коагулянтной активности по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (Долгов, Свирин, 2005); фибринолитиче-
ской активности — суммарной (СФА) и неферментативной (НФ) (Kudrjashov, Lyapina, 1986) (с использованием нестабилизированного фибрина); ферментативную фибринолитическую активность (ФФА) и активность тканевого активатора плазминогена (активность ТАП) эуглобули-новой фракции на прогретых и непрогретых стабилизированных фибриновых пленках (Ан-дреенко, 1981); АДФ-индуцированную агрегацию богатой тромбоцитами плазмы (Долгов и др., 1996).
Статистическая обработка данных была проведена по методу Стьюдента и с использованием непараметрических критериев достоверности.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии экспериментов на здоровых крысах через 1 ч после 4-кратного ежесуточного интраназального введения каждого из пептидов — GP (группа 1), PG (группа 2), PGP (группа 3) и се-макса (группа 4) в дозе 1 мг/кг массы тела отмечалось увеличение антикоагулянтной активности плазмы крови на 20, 78, 51 и 70% соответственно, повышение СФА на 123, 148, 124 и 100% соответственно по сравнению с теми же показателями в контрольной группе животных. При этом в плазме крови опытных крыс НФ возрос после введения GP, PG, PGP и семакса на 135, 100, 50 и 65% соответственно по сравнению с контролем. При введении пептидов GP, PG, PGP и семакса в плазме крови активность ТАП увеличилась на 160, 56, 284 и 512% соответственно по сравнению с тем же показателем в контрольной группе крыс. Кроме того, после применения PGP и семакса наблюдалось достоверное снижение агрегации тромбоцитов (табл. 1). Из этих данных следует, что по неферментативному фибринолитическому действию в плазме крови наибольший эффект обнаруживался у дипептидов, тогда как по показателю активности ТАП плазмы семакс и PGP превышали подобное действие дипептидов.
На животных, подвергнутых иммобилизаци-онному стрессу в течение 60 мин, было установлено, что такой вид стресса вызывает у крыс состояние гиперкоагуляции и снижение противосверты-вающего потенциала крови за счет уменьшения антикоагулянтной и всех видов фибринолитиче-ской активности плазмы крови (СФА, ФФА, НФ) по сравнению с параметрами гемостаза у нормальных животных (табл. 2, 3).
В последующем изучали влияние интраназаль-ного введения пептидов GP, семакса (табл. 2), PG и PGP (табл. 3) на плазменный и тромбоцитар-ный гемостаз крыс при однократном (остром) иммобилизационном стрессе.
Показано, что при 60-минутном иммобилиза-ционном стрессе у животных на фоне предвари-
Таблица 1. АЧТВ, СФА, НФ, активность ТАП, АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов в плазме крови после интраназального 4-кратного применения пептидов GP, PG, PGP и семакса в дозе 1 мг/кг массы тела (M ± m)
Вводимый препарат Показатель крови, %
АЧТВ СФА НФ активность ТАП агрегация тромбоцитов
GP (группа 1) 120 ± 6.7* 223 ± 8.2** 235 ± 5.5** 260 ± 5.8** -
PG (группа 2) 178 ± 7.1** 248 ± 9.1 200±11** 156 ± 9.7** -
PGP (группа 3) 151 ± 4.3** 224 ± 12.6 150 ± 3.5** 384±14** 60.5 ± 5**
Семакс (группа 4) 170 ± 5.7** 200 ± 5.5** 165 ± 6.3** 612±21** 65.6 ± 5**
0.85%-ный NaCl 100 ± 8.9 100 ± 6.8 100 ± 10.1 100 ± 5.8 100 ± 6.5
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля с 0.85%-ным раствором №С1: *р < 0.05; **р < 0.01.
Таблица 2. АЧТВ, СФА, НФ, ФФА, активность ТАП, АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов в плазме крови крыс при развитии у них иммобилизационного стресса в течение 60 мин на фоне интраназального 4-кратного применения ОР и семакса в дозе 1 мг/кг массы тела (М ± т)
Показатель крови, %
Условие опыта АЧТВ СФА НФ ФФА активность ТАП агрегация тромбоцитов
Норма Иммобилизация на фоне №
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.