НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 4, с. 305-310
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.8.015:576.345
ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ ГАНГЛИОЗИДА GDb И ИНГИБИТОРОВ СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА ПРИ ДЕЙСТВИИ НА КЛЕТКИ PC12 БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА
© 2012 г. Л. В. Баюнова, Ю. А. Власова, Т. В. Соколова, И. О. Захарова,
Р. Г. Парнова, Н. Ф. Аврова*
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии
им. И.М. Сеченова РАН
Показано, что липополисахарид из Escherichia coli серотипа 0111 B4 (ЛПС) в концентрации 0.125 и 0.25 мг/мл оказывает токсический эффект на клетки нейрональной линии РС12 в среде DMEM. Более высокие концентрации ЛПС необходимы, чтобы вызвать гибель клеток РС12 в сывороточной среде. Неспецифический ингибитор синтазы оксида азота (NOS) и ингибитор ее индуцибельной формы (iNOS) увеличивают жизнеспособность клеток РС12 при действии на них ЛПС, а ингибитор циклооксигеназы 1/2 (COX 1/2), напротив, увеличивает гибель клеток. Найдено, что ганглиозид GD1a в концентрации 50 и 100 мкМ повышает жизнеспособность клеток РС12 в среде DMEM при действии ЛПС и снижает аккумуляцию активных форм кислорода, индуцированную ЛПС. Полученные данные позволяют предполагать, что активация NOS, особенно iNOS, вносит вклад в токсический эффект ЛПС на клетки РС12, а активация COX 1/2, напротив, приводит к снижению этого эффекта. Защитный и антиоксидантный эффект ганглиозида GD1a на клетки РС12 при действии ЛПС, возможно, зависит от способности ганглиозидов при их встраивании в мембраны изменять структуру рафтов и предотвращать активацию TLR рецепторов клеточных мембран.
Ключевые слова: липополисахарид, клетки РС12, ганглиозид GD1a, ингибиторы синтазы оксида азота, защитный эффект, ингибитор COX1/2, окислительный стресс.
ВВЕДЕНИЕ
Действие липополисахаридов (ЛПС) и других бактериальных токсинов на клетки мозга приводит к возникновению различных форм бактериальных менингитов, для которых характерно развитие воспалительных процессов. По современным представлениям хронические воспалительные процессы вносят существенный вклад и в патогенез многих нейродегенеративных болезней, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и множественный склероз. При этом в развитии воспаления и окислительного стресса, в образовании ци-токинов важнейшую роль играет микроглия мозга [1—2]. Наряду с этим прямое действие бактериальных ЛПС на нервные клетки, которое многократно усиливается в присутствии провос-палительных цитокинов, например ТЫБ-а, приводит к активации свободнорадикальных реакций в клетках и их гибели. Многие природные соединения, обладающие защитным эффектом на нервные клетки против токсического действия ЛПС, обладают антиоксидантным эффектом, уменьшают образование активных форм кисло-
* Адресат для корреспонденции: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44, тел. (812) 5528035, e-mail: avrova@iephb.ru.
рода (АФК) в клетках, индуцированное бактериальным ЛПС [3-4].
Представляет интерес выяснение вопроса о том, какую роль в гибели нервных клеток и клеток нейрональных линий при действии ЛПС играет модуляция активности синтаз оксида азота (NOS), прежде всего индуцибельной формы фермента (iNOS), а также циклооксигеназы 1/2 (COX 1/2). Данные о роли модуляции активности COX 1/2 в реализации действия ЛПС и других токсинов на нервные клетки очень противоречивы [5-9]. Среди природных нейропротекторов, обладающих антиоксидантной активностью, выделяются ганглиозиды, основным местом их локализации у животных являются мембраны нервных клеток мозга. В большом числе работ показано, что ганглиозиды повышают жизнеспособность нервных клеток в культуре и нейронов мозга in vivo при действии возбуждающих аминокислот или других токсинов, а также при ишемических воздействиях [10-14]. Есть данные о предотвращении ганглиозидами гибели клеток слизистой кишечника, вызванной токсическим действием ЛПС [15-16]. Однако авторам статьи не встретилось работ, в которых бы исследовалась способность ганглиозидов повышать жизнеспособность нейронов или клеток нейрональных линий при
действии на них ЛПС, хотя при менингитах и ме-нингоэнцефалитах ганглиозиды, высвобождающиеся из разрушенных клеток [17], могут, по-видимому, оказывать защитный эффект, предохраняя оставшиеся нейроны от разрушения.
Цель настоящей работы — изучение влияния ингибиторов NOS и COX 1/2 и одного из основных ганглиозидов мозга млекопитающих GD1a на жизнеспособность клеток нейрональной линии РС12, подвергнутых действию токсических концентраций ЛПС, а также оценка способности ганглиозида GD1a оказывать антиоксидантный эффект, уменьшая образование АФК, вызванное ЛПС.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалы. Липополисахарид из Escherichia coli, серотип 0Ш:Б4 (ЛПС), ингибитор COX 1/2 диклофенак и ингибитор синтазы оксида азота метиловый эфир N-нитро-Ь-аргинина (L-NAME) были приобретены у фирмы Sigma (США), ингибитор iNOS - (1400W) и nNOS (7-нитроиндазол) у фирмы Biomol (США), MTT у фирмы Aldrich (США), пенициллин и стрептомицин у фирмы Serva (Германия). Инкубационная среда DMEM c L-глутамином, сыворотки крови лошади и плодов коровы были куплены у фирмы Биолот (Россия).
Условия культивирования клеток. Опыты проводили на нейрональной клеточной линии РС12. Клетки выращивали в среде DMEM с L-глутами-ном, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы и 5% сыворотки крови лошади, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина G. Для определения жизнеспособности клеток МТТ методом посев клеток РС12 осуществляли в 96-луночные планшеты, для определения образования АФК посев клеток проводили в 24-луночные планшеты. Преинкубацию клеток РС12 с ингибиторами NO синтазы — 20 мкМ 1400W, 5 mM L-NAME и 100 мкМ 7-нитроиндазо-ла и с ингибитором COX-1/2 диклофенаком в концентрации 100—500 мкМ проводили в течение 0.5 ч, с 50 и 100 мкМ ганглиозида GD1a в течение 2 ч, с ЛПС клетки инкубировали в течение 24 ч.
Определение жизнеспособности клеток методом, основанным на восстановлении МТТ. В основе метода [18] лежит способность митохондрий жизнеспособных клеток восстанавливать в окрашенный формазан 3-(4,5-диметилтиазол)-2,5-дифенил-2-тетразолиум бромид (МТТ). Погибшие клетки не обладают этой способностью. Клетки РС12 рассеивали в 96-луночные планшеты по 5 х 104 клеток в каждую лунку. Инкубация с ингибиторами проводилась в течение 0.5 ч, с ган-глиозидом GD1a в течение 2 ч до добавления в инкубационную среду разных концентраций
ЛПС. За 2 ч до окончания инкубации с ЛПС добавляли МТТ до конечной концентрации 0.5 мг/мл, после этого клетки лизирования в 20% SDS, в 50%-ном растворе диметилформамида в 0.05 N HCl. Продукт восстановления — формазан определяли, измеряя оптическую плотность раствора при 570 нм, используя ридер для планшетов. В качестве контроля использовали клетки РС12, не подвергшиеся воздействию ингибиторов, GD1a и ЛПС, величину абсорбции в контроле принимали за 100%. Результаты выражали как процент оптической плотности в пробах от ее величины в контроле после вычитания фоновой оптической плотности из всех проб.
Определение аккумуляции АФК в клетках РС12 при действии ЛПС и ганглиозида GD1a. Для определения содержания АФК клетки РС12 переносили в 24-луночные планшеты из расчета 2 х 105 клеток на лунку. Эксперименты начинали через 24 ч после посева клеток. К клеткам добавляли свежую среду DMEM с L-глутамином, инкубировали при 37°С в течение 1 ч с ганглиозидом GDla и затем в течение 3 ч с ЛПС в концентрации 0.125 и 0.25 мг/мл. Флуоресцентный краситель дихлородигидрофлу-оресцеин-диацетат вносили в среду за 15 мин до окончания инкубации с ЛПС в конечной концентрации 10 мкМ. Для удаления избытка красителя клетки промывали раствором Хэнкса. Флуоресценцию продукта реакции АФК с флуоресцентным красителем измеряли на флуориметре Fluo-roscan FL (ThermoFisher, Финляндия). Результаты регистрировали при длине волны эмиссии 538 нм, длине волны возбуждения 485 нм [19]. Содержание АФК выражали в условных единицах, отражающих интенсивность флуоресценции.
Выделение ганглиозида GD1a из мозга быка.
Суммарные ганглиозиды изолировали из мозга быка по Фолчу [20]. GD1a выделяли из ганглиозидов мозга быка с помощью препаративной колоночной хроматографии на силикагеле КСК (Россия), получая частицы силикагеля размером 20—40 микрон. В качестве растворителей использовали смесь хлороформа, метанола и воды в соотношении 65 : 25 : 4 (по об.) и 65 : 35 : 7 (по об.). Выделенный препарат GD1a подвергали очистке, как описано ранее [11]. Чистота использованного в работе препарата ганглиозида GD1a составляла не менее 98%, что показано с помощью тонко -слойной хроматографии на силикагеле, используя пластинки HPTLP фирмы Merck, Darmstadt (Германия).
Статистический анализ. Данные представлены как среднее ±S.E.M. Статистическую достоверность различий между тремя и более группами данных определяли на основании однофакторно-го дисперсионного анализа (ANOVA), используя Tukey's тест для множественных сравнений. При сравнении двух групп данных применяли i-крите-
ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ ГАНГЛИОЗИДА GDb И ИНГИБИТОРОВ
307
рий Стьюдента. Различия считали достоверными прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Показано, что ЛПС из Escherichia coli серотипа 0111 : B4 в концентрации 0.125 и 0.25 мг/мл оказывает токсический эффект на клетки нейро-нальной линии РС12 в среде DMEM. ЛПС в концентрации 0.125 мг/мл снижал жизнеспособность клеток РС12 примерно в 2 раза, а ЛПС в концентрации 0.25 мг/мл — почти до нуля (табл. 1).
В полной среде инкубации, содержащей 15% сыворотки крови лошади и плодов коровы, токсический эффект ЛПС на клетки РС12 менее выражен. Он проявляется при его концентрации 1 мг/мл, жизнеспособность клеток при этом составляет в среднем 49.2 ± 11.9% от контроля (n = 6). Эти результаты согласуются с литературными данными. Так, показано, что экспозиция клеток РС12 1 мг/мл ЛПС серотипа 0111 : B4, использованного в опытах, или серотипа 055 : B5 снижает жизнеспособность клеток РС12 в среде, содержащей 15% сыворотки, в среднем до 40—50% от контроля [4, 21—23]. При этом в отдельных опытах потеря жизнеспособности может быть намного большей. 0.5 мг ЛПС/мл п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.