БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.468:631.86.:631.445.2.:631.452
ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕНОЛПЕРОКСИДАЗ И ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗ В СОВРЕМЕННЫХ И ПОГРЕБЕННЫХ ПОЧВАХ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ*
© 2014 г. А. В. Якушев1, И. Н. Кузнецова2, Е. В. Благодатская2, С. А. Благодатский2
Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы
e-mail: ajyakushev84@mail.ru 2Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, 142290, Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2 Поступила в редакцию 14.08.2013 г.
В условиях глобального потепления климата изменение запасов почвенного гумуса зависит от температурной чувствительности полифенолпероксидаз (ПФПО) и полифенолоксидаз (ПФО). Они играют важную роль в разложении лигнина, минерализации и образовании гумуса. Зависимость потенциальной активности ферментов от температуры изучали в современной и погребенной серой лесной почве в ходе ее инкубации при температуре 10 или 20° С. Результаты эксперимента свидетельствуют, что она определялась доступностью субстрата и наличием кислорода. Активность ПФО в ходе двухмесячной инкубации без доступа кислорода уменьшилась в 2—2.5 раза, что компенсировалось возросшей в 2—3 раза активностью ПФПО. Увеличение температуры инкубации до 20°С и внесение глюкозы ускоряло этот переход за счет более резкого уменьшения активности ПФО. Предынкубация почвы с глюкозой приводила к двукратному увеличению активности ПФПО, но недостоверно изменяла активность ПФО. Различный эффект влияния температуры на две группы исследованных оксидаз и возможность "замещения" активности одного типа ферментов другим при изменении условий аэрации следует учитывать при прогнозировании эффекта потепления климата на минерализацию органического вещества почвы. Отсутствие достоверных отличий в ферментативной активности между погребенными и современными горизонтами почвы свидетельствует о сохранении погребенной почвой части своих свойств ("память почвы") и быстром восстановлении высокого уровня ферментативной активности в ходе предынкубации.
Ключевые слова: глобальное изменение климата, анаэробные условия, температура почвы, ферментативная активность почвы.
Б01: 10.7868/80032180X14050268
ВВЕДЕНИЕ
Внеклеточные почвенные ферменты осуществляют процессы окисления и гидролиза полимерных органических соединений, контролируя баланс между разложением поступающих в почву растительных остатков и образованием устойчивых гумусовых соединений. Активность внеклеточных ферментов определяет скорость образования растворимых органических соединений, доступных почвенным микроорганизмам. Считается, что эта ступень является лимитирующей в цепочке биохимических превращений, ведущих к минерализации органического вещества почвы до СО2 [5, 9].
* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12-04-01170-а и 12-04-31159-мол_а.
Внеклеточные гидролитические ферменты, участвующие в деградации, трансформации и минерализации органического вещества почвы изучены достаточно подробно. В частности, изменению активности целлюлаз, фосфатаз и других гидролаз посвящены обширные исследования [6] и во многих случаях реакция ферментной системы почвы на изменение физико-химических свойств почв и температуры хорошо известна [7, 13]. В противоположность этому, фенолоксида-зы и пероксидазы, активность которых часто не коррелирует с активностью гидролаз, были изучены в небольшом количестве работ по почвенным ферментам [12]. При этом важную роль в формировании гумусовых веществ, устойчивых к разложению, отводят именно ПФО и ПФПО, участвующим в превращениях соединений ароматического ряда. Они катализируют окисление моно-, ди-, трифенолов до хинонов в присутствии кис-
лорода воздуха или перекиси водорода [3]. В соответствующих условиях хиноны при конденсации с аминокислотами и пептидами образуют первичные молекулы протогуминовых кислот и тем самым иммобилизируют углерод в почвенном гумусе, препятствуя его накоплению в атмосфере в виде углекислого газа. Грибы, некоторые бактерии и археи образуют лакказы и лигнин-пероксидазы, участвующие в разложении лигнина в почве. Синтез меланиноподобных веществ у грибов и лигнина у растений, то есть органических молекул, участвующих в образовании гумуса, идет при участии фенолоксидаз. Таким образом, фенол- и пероксидазы ответственны за несколько процессов, важных на экосистемном уровне: минерализацию лигнина и синтез вторичных соединений, участвующих в гумификации. Но в то же время высокая активность оксидаз приводит к увеличению интенсивности минерализации органического вещества и уменьшению его содержания в почве.
Фенолоксидазы и пероксидазы менее стабильны в окружающей среде, чем внеклеточные гидролазы [12]. Высокая пространственно-временная изменчивость этих ферментов в почве затрудняет установление четких связей с почвенными свойствами и факторами окружающей среды. Поэтому определение температурной чувствительности ферментов этой группы представляется актуальным в свете прогнозируемых изменений климата и увеличения риска ускоренной минерализации органического вещества почвы, приводящей к эмиссии С02. Для обоснованной оценки изменений масштабов минерализации органического вещества почвы при повышении температуры следует учитывать значительное количество углерода (по грубым оценкам более 50% [4]), содержащееся в горизонтах почвы глубже 20—30 см. Особый интерес представляет сравнительное изучение современных и более древних (погребенных) почв. Некоторые погребенные горизонты, сформировавшиеся в XIX в., в самом конце эпохи похолодания в Европе — "малого ледникового периода", отличаются высоким содержанием органического вещества, которое может минерализоваться при изменении климатических условий [1, 11]. Определение температурной чувствительности ферментов, участвующих в минерализации и трансформации органических веществ в различных горизонтах почвенного профиля, необходимо для моделирования и прогнозирования этих процессов в условиях глобального потепления климата. Важно определить активность исследуемых ферментов в микрозонах, богатых органическим веществом (ризосфере, кишечнике беспозвоночных), где она может достигать максимальных значений, а также ее зависимость от температуры. Вклад активности в этих "горячих точках" в общий поток СО2 из почвы может быть
Таблица 1. Химические свойства серой лесной почвы
Горизонт Глубина, см Гумус N рН водный
%
А, 1-11 4.06 0.14 5.75
ВИ, 24-38 0.73 0.02 5.44
[А], 83-96 0.62 0.15 7.17
[В11], 109-130 0.33 0.07 7.14
определяющим для оценки влияния потепления на процессы минерализации органического вещества. Поэтому в работе предусмотрены варианты опыта с внесением глюкозы и инкубации образцов в закрытых флаконах для моделирования микроаэрофильных условий, возникающих в кишечнике животных и ризосфере растений при интенсивном корневом дыхании.
Цель исследования заключалась в изучении активности полифенол-пероксидаз и полифено-локсидаз при разной температуре в современных и погребенных почвах в ходе инкубационного опыта, включающего варианты с нативной, не-обогащенной субстратом почвой, а также с почвой, в которую была внесена глюкоза.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Ферментативную активность и ее зависимость от температуры определяли в образцах, отобранных из почвенного разреза, заложенного на мелиоративном земляном валу (Московская обл., Сер-пуховский р-н вблизи опытно-полевой станции ИФХиБПП РАН), сооруженном А.Т. Болотовым около 200 лет назад (по устному сообщению С.В. Губина). Профиль включает в себя современную (гор. А и ВИ) и погребенную на протяжении 100 лет (гор. [А] и [ВИ]) серую лесную почву (табл. 1). В ходе лабораторной инкубации исследовали динамику ферментативной активности после увлажнения почвы до 60% от полевой вла-гоемкости при двух температурах: 10°С (среднегодовая температура почвы в настоящее время) и 20°С. Увеличение температуры на 10°С было выбрано для получения контрастного эффекта в условиях модельного опыта. Для моделирования поступления легкодоступного органического вещества в почву (например, с корневыми экссудатами и из кишечного тракта беспозвоночных) был предусмотрен вариант с добавлением глюкозы.
Образцы почвы (5 г), просеянные через сито 2 мм, помещали в стеклянные флаконы объемом 15 мл, предынкубировали при температуре 10 или 20° С в течение семи суток, затем добавляли воду или глюкозу в концентрации 4 мг/г почвы для гор. А современной почвы, и в концентрации 2 мг/г почвы для погребенных почв и гор. В — и
т н
о з
и р
о
I-Ч
Глубина, см
A
10
B
I 40
[A]
100
[B] 130 -
A 10 B
II 40
[A]
100
[B] 130
0
1 сут
3 сут
60 сут
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0
1.0 1.5 2.0 2.5 0
1.0 1.5 2.0 2.5
■а - -*- -б
Скорость реакции, о. е./г в час
Рис. 1. Динамика активности ПФО по горизонтам серой лесной почвы в ходе лабораторной инкубации без глюкозы (I) и с добавлением глюкозы (II), здесь и далее температура предынкубации: а — 10°С, б — 20°С. Скорость реакции приведена в оптических единицах на грамм почвы в час (о.е./г в час).
продолжали инкубацию. Флаконы с почвой закрывали резиновыми пробками и инкубировали, не проветривая. Таким образом, условия эксперимента соответствовали особенностям аэрации почвы в нижних горизонтах (включая погребенные), где содержание кислорода в почвенном воздухе на порядок меньше, чем в атмосферном воздухе. На первые, третьи и 60-е сутки почву части флаконов подвергали деструктивному разбору и использовали для определения ферментативной активности после инкубации при 20 или 10°С.
Активности ПФПО и ПФО в почвах определяли при температуре 20°С по методике, изложенной в работе [8]. В качестве субстрата ферментативных реакций использовали тетраметилбензи-дин. Образование продукта реакции определяли колориметрически на имунноферментном анализаторе "Sunrise" фирмы Tecan при 620 нм.
Статистическая обработка и анализ данных. Полученные данные были подвергнуты многофакторному дисперсионном анализу с целью выяснить величины и достоверность эффектов, а также оценить вклад каждого из четырех исследованных факторов (температуры предынкубации почвы, расположения образцов в профиле почвы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.