научная статья по теме ЗАВИСИМОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО α-ХИМОТРИПСИНА В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЯХ ОТ КОМПОЗИЦИИ МИКРООКРУЖЕНИЯ (ЖЕСТКОЙ МАТРИЦЫ И ГИДРАТИРУЮЩИХ ДОБАВОК) Химия

Текст научной статьи на тему «ЗАВИСИМОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО α-ХИМОТРИПСИНА В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЯХ ОТ КОМПОЗИЦИИ МИКРООКРУЖЕНИЯ (ЖЕСТКОЙ МАТРИЦЫ И ГИДРАТИРУЮЩИХ ДОБАВОК)»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 11, с. 825 - 827

УДК 577.152342.1*1.042

ЗАВИСИМОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО а-ХИМОТРИПСИНА В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЯХ ОГ КОМПОЗИЦИИ МИКРООКРУЖЕНИЯ (ЖЕСТКОЙ МАТРИЦЫ И ГИДРАТИРУЮЩИХ ДОБАВОК)

© 1995 г. Э. О. Каменская*, И. К. Сакодынекая, А. В. Левашов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 118899, Москва, Воробьевы горы Поступила в редакцию 02.02.95 г.

Исследована зависимость каталитической активности иммобилизованного на вискозном носителе а-химотрипсина в смесях изопропанол-вода (Н20 < 10%) от содержания воды. Найдено, что добавление циклического полиэфира 18-краун-6 в раствор а-химотрипсина перед иммобилизацией приводит к значительному (в 7 - 10 раз) увеличению ферментативной активности в исследуемой системе, при этом каталитическая активность составляет примерно 10% от наблюдаемой в водном растворе.

Ключевые слова: а-химотрипсин иммобилизованный; ферментативный катализ в водно-органических смесях; полиэфир 18-краун-6.

Биокатализ в водно-органических смесях с низким содержанием поды - самостоятельный раздел энзимологии, интенсивно развивающийся в последние годы [I, 2]. Поиск условий, при которых наблюдается наибольшая каталитическая активность ферментов, важен для выяснения способов организации и функционирования ферментов, в частности для выяснения роли воды в биокатализе. Работа в этом направлении важна с точки зрения прикладной энзимологии в плане создания эффективных технологичных биокатализаторов.

Непосредственный контакт молекулы фермента с молекулами органического растворителя приводит к изменению каталитически активной кон-формации молекулы фермента (инактивации) [3]. Один из способов защиты фермента от этого нежелательного процесса заключается в закреплении его активной конформации путем включения молекулы фермента в жесткую матрицу. Это реализуется при нековалентной иммобилизации фермента на твердом носителе (молекулы фермента включаются в тесные поры носителя) или при лиофилизации (активный фермент включается в жесткую структуру, формирующуюся при лиофилизации) [4].

Однако для достижения высокого уровня ферментативной активности в водно-органических смесях с низким содержанием воды часто бывает недостаточно только защитить фермент от денатурации органическим растворителем. Необходимо также повысить локальную концентрацию воды около молекулы фермента [5], что может быть достигнуто добавлением в раствор фермен-

Сокращения: ВТЫА - л-нитроанилид М-бензоил-£,-тирозина,

Е - а-химотрипсин, СЕ - полиэфир 18-краун-6.

* Автор для переписки.

та перед лиофилизацией или иммобилизацией веществ, обладающих гидратирующими свойствами. Такие вещества мы предлагаем называть гидратирующими добавками. В литературе описан ряд примеров, когда введение в раствор фермента перед лиофилизацией низкомолекулярных неорганических ("буферных") солей [41, веществ, имеющих в своем составе гидроксильные группы и простые эфирные связи (многоатомных спиртов [6], углеводов [7, 8], полиэтиленгликолей [7], т.е. соединений, которые можно рассматривать как гид-ратирующие добавки), на несколько порядков повышало каталитическую активность лиофили-зованных ферментов, суспендированных в органическом растворителе или водно-органической смеси с низким содержанием воды. Следует отметить, что роль гидратирующих добавок ограничивается не только созданием благоприятного водного окружения фермента, но и участием этих веществ в формировании жесткой матрицы вокруг фермента во время лиофилизации или иммобилизации.

Простые циклические полиэфиры (краун-эфиры) также можно рассматривать как эффективные гидратирующие добавки: было показано, что добавление полиэфира 18-краун-6 в раствор химотрипсина перед лиофилизацией увеличивает каталитическую активность суспендированного лиофилизованного фермента [9, 10]. Цель настоящей работы - исследование влияния полиэфира 18-краун-6 (далее краун-эфир) как гидратирующей добавки на каталитическую активность иммобилизованного а-химотриисина (далее химотрипсии).

Изучение гидролиза ВТЫА, катализируемого иммобилизованным на вискозе химотрипсином, в присутствии разных количеств краун-эфира показало (рис. 1), что каталитическая активность

826

КАМЕНСКАЯ и др.

Рис, 1. Зависимость активности иммобилизованного химотрипсина от содержания краун-эфира в растворе фермента перед иммобилизацией. [ВТЫА] 1 мМ. Условия см. в "Экспер. масти"; изопропанол-вода, 17 : 3.

Содержание воды, %

Рис. 2. Зависимость от содержания воды в системе каталитических констант гидролиза ВТГ'М, катализируемого химотрипсином, иммобилизованным без добавок (/) и в присутствии краун-эфира (2) ([СЕ]/[Е] 6000 моль/моль). Условия см. в "Экспер. части".

химотрипсина максимальна при соотношении [СЕ]/[Е] = 6000 моль/моль. Подобная зависимость для лиофилизованного фермента также представляет собой кривую с максимумом при соотношении [СЕ]/[Е], равном 250 моль/моль [10]. Дальнейшие исследования проводили, добавляя оптимальное количество полиэфира в раствор фермента перед иммобилизацией. Удаление носителя с ферментом из реакционной сме.си приводит к прекращению гидролиза субстрата. Это свидетельствует о том, что вся наблюдаемая каталитическая активность локализуется на носителе.

Добавление краун-эфира при иммобилизации химотрипсина ведет к значительному (в 7 - 10 раз) увеличению ферментативной активности (рис. 2). По нашему мнению, этот эффект обусловлен влиянием краун-эфира как гидратирующей добавки. В системе органический растворитель-но-ситель-иммобилизованный на носителе фермент происходит перераспределение воды между ком-

понентами системы в соответствии с их сродством к воде. Согласно данным [5, 11, 12], каталитическая активность фермента определяется локальной концентрацией воды на носителе вблизи фермента, а не общим содержанием воды в системе. Присутствие на носителе краун-эфира, по-видимому, приводит к увеличению локальной концентрации воды около фермента и, как следствие, к росту каталитической активности. Кроме того, мы полагаем, что присутствие краун-эфира во время иммобилизации способствует включению молекулы фермента в матрицу с жесткой структурой, которая закрепляет активную кон-формацию фермента и защищает его от денатурации молекулами органического растворителя.

Каталитическая активность химотрипсина при низком (меньше 10%) содержании воды в изопро-паноле в присутствии краун-эфира сохраняется на уровне 5 - 10% его активности в воде - кса, 9 х х 10^2 с"1 (рис. 2). Следует подчеркнуть, что в отсутствие гидратирующих добавок в водно-орга-нических системах с низким содержанием воды каталитическая активность иммобилизованных и суспендированных ферментов обычно не превышает 1 - 2% их активности в воде [4, 10 - 12].

Таким образом, в работе предложен способ повышения каталитической активности иммобилизованных ферментов в системах с низким содержанием воды путем подбора композиции микроокружения фермента: введение в раствор фермента перед иммобилизацией гидратирующих добавок и закрепление активной конформации фермента в процессе иммобилизации.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали циклический полиэфир 18-кра-ун-6, BTNA и N-транс-циннамоилимидазол (Sigma, США); растворители и низкомолекулярные вещества отечественного производства (марок ч. д. а. и ос. ч.) без дополнительной очистки.

а-Химотрипсин из поджелудочной железы быка (КФ 3.4.21.1, Sigma, США) дополнительной очистке не подвергался. По данным титрования активных центров N-тряноциннамоилимидазо-лом по стандартной методике [13], содержание активного фермента в препарате составляло 62%. Носителем для иммобилизации химотрипсина служил коммерческий образец ткани из вискозного волокна.

Иммобилизацию химотрипсина проводили на квадратных кусочках (6x6 мм) вискозного носителя. Раствор химотрипсина (4 х Ю-5 М) готовили в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.9 (буфер А), в присутствии такого количества краун-эфира, которое удовлетворяло соотношению [СЕ]/[Е] = 100 - 20000 моль/моль. Раствор фермента (30 мкл) наносили в центр квадрата из носителя, который затем сушили 2 ч на воздухе при комнатной температуре до постоянной массы или

^ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 21 № 11 1995

ЗАВИСИМОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО а-ХИМОТРИПСИНА

827

высушивали лиофильно. Каталитическая активность препаратов, высушенных на воздухе и лиофильно, была одинаковой (с учетом экспериментальной ошибки). Специально было показано, что удельная активность химотрипсина не зависит от исходной концентрации фермента в растворе при [Е] < 8 х 1 Cr5 М и резко уменьшается при более высоких исходных концентрациях фермента. Этот факт можно объяснить повышением скорости автолиза при увеличении концентрации химотрипсина. Контрольные препараты иммобилизованного химотрипсина готовили так же, но без добавления краун-эфира. Аналогично получали контрольные препараты носителя с краун-эфиром, но без фермента.

Определение каталитической активности химотрипсина в водных растворах. К 2 мл буфера А добавляли 2-18 мкл 3 мМ раствора BTNA в диок-сане и 10 мкл 1.6 х 10"4 М раствора химотрипсина в 1 мМ HCl. За образованием продукта реакции (n-нитроанилина) следили, определяя оптическое поглощение раствора (20°С, Я 385 нм) с использованием двулучевого спектрофотометра Beckman Е-25 (США) с термостатируемым кюветным отделением.

Отдельно было показано, что добавки органического растворителя (до 10 об. %), вносимые с запасным раствором субстрата, не влияют на наблюдаемые скорости реакции.

Определение каталитической активности иммобилизованного химотрипсина в смесях изопро-панол-вода. В спектрофотометрической кювете смешивали 10 - 200 мкл 30 мМ раствора BTNA в диоксане, 60 - 400 мкл воды и изопропиловый спирт так, чтобы объем смеси был равен 2 мл. Реакцию начинали введением в кювету вискозного носителя с иммобилизованным химотрипсином и проводили при механическом встряхивании. За ходом реакции следили спектрофотометрически, как описано выше, периодически определяя величину оптического поглощения в системе (при этом

носитель с ферментом опускался на дно кюветы и не попадал в световой пучок

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком