ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 678-685
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ ЛИПИДОВ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ГЕНОМ А12-ДЕСАТУРАЗЫ
ЦИАНОБАКТЕРИЙ
© 2007 г. Р. Маали Амири*, И. В. Голденкова-Павлова**, Н. О. Юрьева***, В. П. Пчёлкин***, В. Д. Цыдендамбаев***, А. Г. Верещагин***, А. Н. Дерябин***, Т. И. Трунова***, Д. А. Лось***, А. М. Носов****
* Отдел агрономии и селекции растений Сельскохозяйственного колледжа Тегеранского университета, Тегеран ** Институт общей генетики им. Н И. Вавилова Российской академии наук, Москва *** Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва **** Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 04.12.2006 г.
Ген desA, кодирующий Д12-ацил-липидную десатуразу ЖК в цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, был экспрессирован в растениях картофеля (Solanum tuberosum L.). Для оценки эффективности экспрессии гена десатуразы в растениях его последовательность была трансляционно слита с последовательностью репортерного гена, кодирующего термостабильную лихеназу. Сравнительный анализ экспрессии нативного и гибридного генов показал, что лихеназа в составе гибридного белка сохраняла как активность, так и термостабильность, а десатураза сохраняла способность катализировать введение двойной связи в цепи ЖК и, тем самым, модифицировать их состав в липидах мембран. В надземных органах большинства трансформированных растений абсолютное содержание отдельных полиненасыщенных ЖК - линолевой и линоленовой, а также суммы ненасыщенных кислот было, соответственно, на 39-73, 12-41 и 20-42% выше контроля. Кратковременное жесткое охлаждение всех трансформантов до -7°С никак не повышало интенсивность перекисного окисления их мембранных липидов; в то же время у контрольных растений оно в этих условиях значительно (на 25%) возрастало по сравнению с неохлажденным вариантом. Все эти различия могут свидетельствовать о более высоком уровне устойчивости трансформированных растений к гипотермии и вызванному ею окислительному стрессу.
Solanum tuberosum - трансформированные растения - ацил-липидная десатураза - ЖК - холодостойкость
ВВЕДЕНИЕ
Изменение качественного и количественного состава ЖК высших растений привлекает к себе внимание исследователей по двум причинам: во-первых, изменение ненасыщенности ЖК считается главным фактором устойчивости растений к стрессам, прежде всего, температурным; и, во-вторых, растительные масла с высоким содержанием незаменимых полиненасыщенных ЖК особенно необходимы для получения высококачественных продуктов питания [1, 2].
Сокращения: АПБ - ацил-переносящий белок; АФК - активные формы кислорода; МДА - малоновый диальдегид; МЭЖК - метиловый эфир ЖК; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ПЦР - полимеразная цепная реакция; CaMV -вирус мозаики цветной капусты.
Адрес для корреспонденции: Носов Александр Михайлович. 119992 Москва, Воробьевы горы. Московский государственный университет, биологический факультет, кафедра физиологии растений. Электронная почта: al_nosov@mail.ru
Растения адаптируются к изменениям окружающей среды, прежде всего, за счет сдвигов в клеточном метаболизме, обусловленных дифференциальной экспрессией различных генов. Биомембраны клеток растений являются важными участниками как восприятия биотических и абиотических стрессов, так и защитных механизмов в ответ на действие стрессовых факторов [3]. Мембраны обладают свойством текучести, которая играет большую роль в восприятии термосигналов из окружающей среды и в активации функции ряда мембраносвязанных ферментов [4]. Ли-пиды, содержащие двойные связи в остатках ЖК, обладают более низкой температурой фазового перехода по сравнению с насыщенными липида-ми [5]. При последовательном снижении внешней температуры происходит уменьшение текучести мембран вплоть до разрушения липидов мембранных структур клетки [6]. Обычно клетки обладают защитными системами для контроля над
Таблица 1. Нуклеотидная последовательность праймеров для проведения ПЦР
Наименование олигонуклеотида Последовательность (5'-3')
LicBM3-sense-BamH1 LicBM3-anti-Sph1 DesA-sense-Xho1 DesA-anti-Bg/II GGATCCGTGGTAAATACGCCTTTTG GCATGCGTTAGGATAGTATTTTACATATTCG CTCGAGATGACTGCCACGATTCC AGATCTTTGAACTTTTTTCAGGGAGCC
состоянием мембран и в момент изменения условий среды активируют эти системы.
Значительную роль в оптимизации мембранных функций играют десатуразы ЖК, образующие двойные связи в цепях ЖК липидов мембран [7]. Десатуразы ЖК высших растений можно разделить на два типа в зависимости от природы их субстрата: растворимые ацил-АПБ-десатуразы, которые используют ЖК, связанные с ацил-пере-носящим белком (АПБ), и мембраносвязанные ацил-липидные десатуразы, субстратом которых служат остатки ЖК, входящие в состав мембранных липидов [7]. У цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 почти все гены десатураз (кроме гена desC, кодирующего Л9-десатуразу и экспресси-рующегося конститутивно), в том числе ген desA, активируются низкими температурами. Продукт гена desA - Л12-ацил-липидная десатураза - вводит вторую двойную связь в положение Л12-ацильных цепей [7]. Известно, что эта десатураза является ключевым ферментом биосинтеза диеновых ЖК [6, 8]. В связи с этим, увеличенный уровень ее экспрессии посредством генетических методов может служить одним из эффективных путей изменения количества диеновых ЖК.
Следует отметить, что некоторые продукты генов, клонированных в клетках гетерологичных хозяев, либо вообще не проявляют ферментативной активности, либо она определяется лишь при использовании специальных методов исследования. В некоторой степени это справедливо и для продукта гена desA. Поэтому мы предложили новый подход для конструирования экспериментальных моделей с целью создания в дальнейшем трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам [9]. Этот подход основан на конструировании гибридных генов, в которых целевой ген, в данном случае - ген desA, трансляционно слит с последовательностью репортерного гена, кодирующего термостабильную лихеназу (licB). Эта репортерная система имеет ряд преимуществ, позволяя использовать более простые и чувствительные методы для анализа экспрессии гибридного гена и, тем самым, проводить быстрый отбор трансгенных организмов и определять уровень экспрессии гибридных генов и молекулярные массы их белковых продуктов [10].
Целью настоящей работы было исследование возможности повышения уровня ненасыщенных ЖК в мембранных липидах высших растениях за счет экспрессии гена Д12-ацил-липидной десатуразы и выяснение возможности использования термостабильной лихеназы в качестве маркера для исследования экспрессии генов десатураз ЖК.
МЕТОДИКА
Конструирование растительных экспрессион-ных векторов. В работе использовали стандартные процедуры молекулярного клонирования и протоколы полимеразной цепной реакции (ПЦР) [11]. Эндонуклеазы рестрикции, Т4 ДНК-лигазу и Р/и-ДНК-полимеразу применяли, согласно протоколам фирм-изготовителей ("Promega", США; "Fermentas", Литва).
Нуклеотидную последовательность репортерного гена licBM3 получали с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pQE30-licBM2-KM2-Mys25, полученной ранее [10], и праймеры licBM3-sense-BamHI и licBM3-an-ti-SphI (табл. 1) [11]. Амплифицированный фрагмент клонировали в плазмиду pGEM-Т с образованием плазмиды pGEM-licBM3. Последовательность нативного гена desA получали ПЦР, используя геномную ДНК Synechocystis sp. PCC6803 [8] в качестве матрицы и праймеры desA-sense-XhoI и desA-anti-Bg/II ("Евроген", Россия) (табл. 1). Амплифицированный фрагмент гена desA клонировали в вектор pGEM-T с образованием плазмиды pGEM-desA. Далее XhoI-SphI-фрагмент плазмиды pGEM-desA клонировали в вектор pIK, предварительно гидролизованный ферментами XhoI и SphI, с образованием вектора pIK-desA. Плазмиду pIK-desA гидролизовали эн-донуклеазами рестрикции XhoI и XbaI, и XhoI-XbaI-фрагмент, содержащий последовательность desA-гена, клонировали в вектор для трансформации растений pBISN1-IN, предварительно гидролизованный ферментами рестрикции XhoI и XbaI. В результате был получен экспрессионный вектор pBISN1-IN-desA, в котором ген, кодирующий Д12-десатуразу, находится под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (рис. 1).
Конструирование экспрессионного вектора pBISN1-IN-desA-/icBM3 осуществляли в несколь-
Pnos nptII polyA P35S desA ZicBM3 polyA
P B S X E P
Рис. 1. Схема экспрессионных растительных векторов, несущих гибридный ген desA-licBM3, для трансформации растений.
Pnos - промотор гена nptII, кодирующего неомицинтрансферазу II; poly A - полиаденил; P35S - конститутивный промотор для экспрессии целевого гена; desA - ген, кодирующий Д12-ацил-липидная десатуразу. P (PvuII), E (ERI), X (XbaI), S (SalI), B (BHI) - уникальные сайты рестрикции. licBM3 - последовательность репортерного гена, который кодирует термостабильную ß-1,3-1,4-глюканазу (лихеназу) Clostridium thermocellum.
ко этапов. Первоначально BamHI-SphI-фрагмент плазмиды pGEM-/icBM3 клонировали в плазмиду pGEM-desÄ, предварительно гидролизованную ферментами Bg/II и SphI, с образованием плазмиды pGEM-desÄ-/icBM3. Затем XhoI-SphI-фраг-мент плазмиды pGEM-desÄ-/icBM3 клонировали в вектор pIK, гидролизованный ферментами XhoI и SphI, с образованием вектора pIK-desÄ-/icBM3. XhoI-XbaI-фрагмент, содержащий последовательность гибридного гена desÄ-/icBM3 клонировали в pBISN1-IN, по тем же сайтам рестрикции. В результате был сконструирован экспрессионный вектор pBISN1-IN-desÄ-/icBM3, в котором гибридный ген desÄ-/icBM3 находится под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК CaMV (рис. 1). Полученные векторы были перенесены в Agrobacterium tumefaciens, штамм äGlO [12]. В качестве селективного гена использовали ген nptII. Корректность клонирования на-тивного и гибридного гена подтверждена секве-нированием ("Евроген").
Получение трансформированных растений.
Микроклубни среднераннего картофеля (So/anum tuberosum L.) сорта Десница размером 4-5 мм получали в культуре i
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.