ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 223-228
УДК 581.1
ЖИРНОКИСЛОТНЫИ СОСТАВ липидов ВАКУОЛЯРНЫХ МЕМБРАН КОРНЕПЛОДОВ
**
© 2007 г. С. П. Макаренко*, Т. А. Коненкина*, С. В. Хотимченко
*Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск **Институт биологии моря Дальневосточного научного центра Российской академии наук, Владивосток
Поступила в редакцию 10.05.2006 г.
Методом ГЖХ изучен жирнокислотный состав липидов вакуолей из запасающих тканей пастернака (Pastinaca sativa L.), петрушки корневой (Petroselinum crispum L.), и моркови (Daucus carota L.) и рассмотрены возможные пути их биосинтеза. Для липидов вакуолярных мембран характерно высокое содержание (до 78% от суммы) ненасыщенных ЖК с преобладанием линолевой кислоты, содержание которой составляет в липидах вакуолей пастернака - 53.5 %, петрушки - 55.1%, моркови -54.4%. Для жирнокислотного состава липидов вакуолей пастернака и петрушки характерно высокое содержание гексадиеновой С16:2ю6 кислоты (8.0 и 4.6% соответственно). Содержание а-лино-леновой кислоты в липидах вакуолей этих растений составляет 4.4-7.3%. Из насыщенных ЖК в липидах вакуолей этих растений преобладает пальмитиновая кислота (18.0-20.4%).
Pastinaca sativa - Pefroselinium crispum - Daucus carota - вакуолярные мембраны - ЖК
ВВЕДЕНИЕ
Исследование тонопласта и центральных вакуолей высших растений обусловлено двумя основными причинами: первая связана с выяснением роли тонопласта и вакуолей в структурной и функциональной организации клетки и целого организма, а вторая - с возможностью их использования в области мембранной биологии для изучения фундаментальных проблем структуры, состава и функций биомембран [1-7]. Вакуоль в растительной клетке занимает до 90% ее объема и содержит клеточный сок, состоящий из концентрированного раствора солей, углеводов, белков и других метаболитов, и ограничена вакуолярной мембраной - тонопластом. Вакуолярная мембрана изолирует цитоплазму от кислого и гидролитически-активного вакуолярного сока и служит, таким образом, барьером, предотвращающим утечку содержимого вакуолей, а также имеет активно действующие механизмы переноса ряда соединений против градиента концентрации и электрохимической активности. Тонопластные белки при-
Сокращения: АПБ - ацил-переносящий белок, ИН - индекс ненасыщенности, ПНЖК - полиненасыщенные ЖК, ФХ -фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, Е^ -длина алифатической цепи, LDR - активность десатурации линолеата, ODR - активность десатурации олеата. Адрес для корреспонденции: Макаренко Сергей Петрович. 664033 Иркутск, ул. Лермонтова, 132. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: 007 (3952) 51-07-54; электронная почта: makar@sifibr.irk.ru
нимают активное участие в транспорте различных соединений между цитоплазмой и вакуолью [1-4, 6]. В растениях обычно присутствуют два типа вакуолей: запасающие и литические. Лити-ческие вакуоли аналогичны лизосомам животных клеток и вакуолям дрожжей и способны переваривать стареющие или поврежденные орга-неллы, а также обладают тем же набором ферментов (протеазы, гидролазы, пероксидазы, эстеразы и др.) [5, 6, 8]. В зрелых растительных тканях литические и запасающие вакуоли могут сливаться в одну центральную вакуоль, которая функционирует как один общий компартмент [2, 7].
Вакуоль в растительной клетке способна при малых энергетических затратах максимально увеличивать площадь поверхности тонопласта, через которую происходит обмен содержимого между цитозолем и вакуолью. Эти изменения в вакуоле связываются с функциональными перестройками тонопласта в результате сжатия или расширения латеральной поверхности липидного бислоя [10, 11]. Так, изучение архитектуры тонопласта и динамики осмотического стресса в вакуолях, полученных из суспензионной культуры табака, показало, что вакуолярная мембрана является сферической структурой, состоящей из липидных доменов, в которых концентрируются аквапорины [12]. Сферическая структура тонопласта может отображать не только уникальную текучесть и эластичность мембраны, но и специфичность жирнокислотного состава липидов бислоя.
Липиды бислоя вакуолярных мембран растений состоят из глицеролипидов с длинноцепочеч-ными жирнокислотными остатками, преимущественно полиненасыщенных ЖК (ПНЖК), которые обеспечивают протекание осмотических процессов и регуляцию гомеостаза в растительной клетке [12-14]. Высокое содержание липидов в то-нопласте (липид-белковое соотношение 3.5-4.0 : 1) оказывает влияние не только на жидкостные свойства мембраны, но и на активность мембран-но-связанных ферментов, таких как АТФаза, пи-рофосфатаза, липаза и др., а также на экспрессию рецепторов, мембранную проницаемость и ее транспортные свойства [6, 15, 16].
Важная роль в этих процессах отводится деса-туразам ЖК - ферментам, участвующим в биосинтезе ненасыщенных ЖК: ацил-АПБ десатура-зам ЖК, связанным с ацил-переносящими белками (АПБ16:0 и АПБ18:0), и ацил-липидным десатуразам, отличающимся между собой по структуре и свойствам [17-22]. Так, в пластидных мембранах первая двойная связь образуется в цепях ЖК при участии растворимых ацил-АПБ де-сатураз. Дальнейший синтез ненасыщенных ЖК в пластидах осуществляется нерастворимыми ацил-липидными мембранными ю6 (Fad6) и ю3 (Fad7, Fad8) десатуразами, участвующими в образовании второй и третьей двойной связи в цис-конфигурации [18-20]. Например, в Arabidopsis ^аНапа fad3 кодирует микросомальную ю3 деса-туразу [23], тогда как гены fad7 и fad8 кодируют пластидные ю3 десатуразы [24, 25]. В высших растениях гены fad3 и fad7 экспрессировались конститутивно при всех температурах, тогда как ген fad8 экспрессировался только при температуре ниже 20°С [24]. В клетках растений олеиновая кислота, связанная с АПБ, может транспортироваться как в мембраны хлоропластов, так и эндо-плазматический ретикулум для последующей де-сатурации в липид-связанной форме [17, 21, 22]. В цитоплазматических мембранах высших растений синтез ПНЖК осуществляется ацил-липид-ными мембранными ю6 (Fad2) и ю3 (Fad3) десатуразами [17, 19, 20].
Ацил-липидные мембранные ю6 и ю3 десатуразы играют важную роль в устойчивости и акклиматизации растений к низким температурам [19, 20]. Так, при изучении влияния температуры на рост и развитие растений в бобах сои были клонированы два родственных гена fad2-1 и fad2-2, кодирующие две формы ю6 десатуразы. Было показано, что микросомальная Fad2-1 десатураза интенсивно экспрессировалась только в созревающих семенах сои, тогда как Fad2-2 десатураза конститутивно экспрессировалась как в вегетативных тканях, так и в семенах. Ген fad2-1 в запасающих липидах семян сои контролирует конверсию олеиновой кислоты в линолевую, при этом в семенах и тканях листьев сои содержание линоле-
вой и линоленовой кислот увеличивалось с понижением температуры [19]. Молекулярное клонирование и характеристика генов, кодирующих две микросомальные олеатные десатуразы (Fad2-1 и Fad2-2) из оливы, и филогенетический анализ Fad2 и Fad6 десатураз растений показаны также в работе [22].
При изучении фосфолипидного состава и деса-турации ЖК в плазмалемме, выделенной из корней ржи, было установлено, что акклиматизация растений при низких температурах приводила к увеличению содержания а-линоленовой кислоты в фосфатидилхолине (ФХ) и фосфатидилэтанол-амине (ФЭ) с 2 0 до 40%, тогда как содержание ли-нолевой кислоты в этих же липидах, напротив, уменьшалось с 50 до 30% [19]. Введение гена fad3 в культуру табака катализировало синтез С18:2ю6 в С18:3ю3 и приводило, соответственно, к уменьшению уровня линолевой кислоты в ФХ и ФЭ плазмалеммы корней и увеличению содержания а-линоленовой кислоты в этих же липидах. При этом отмечали, что уменьшение температуры с 26 до 15°С не влияло на вязкость мембраны [25]. Из листьев и суспензионной культуры петрушки были получены и функционально идентифицированы пластидные ю3 десатуразы, идентичные Fad7 и Fad8 А. гкаПапа, а также микросомальная ю6 жирнокислотная десатураза, идентичная Fad2 сои и А. гЬаНапа [27, 28].
Отмечалось, что содержание триеновых ЖК в семенах и тканях корней зависит, главным образом, от активности Fad3 десатуразы, локализованной в эндоплазматическом ретикулуме, что приводит к увеличению уровня линоленовой кислоты и уменьшению уровня линолевой [17, 21, 23]. Так, анализ жирнокислотного состава липидов в трансгенных тканях растений показал, что экспрессия ю3 жирнокислотной десатуразы приводила к более, чем 10-кратному увеличению уровня а-линоленовой кислоты в липидах семян А. ^аНапа и корнях моркови [23].
Несмотря на изученность биохимических процессов, обеспечивающих адаптивные изменения липидного состава вакуолярных мембран у отдельных видов растений, таких как арабидопсис, табак, кукуруза, соя, рис и другие при действии низких температур, вопросы устойчивости и липидного метаболизма корнеплодов культурных растений остаются мало изученными. Ранее нами был рассмотрен жирнокислотный состав липидов вакуолей, выделенных из корнеплодов красной столовой свеклы, редиса и турнепса, и показаны некоторые различия в содержании в них ПНЖК [29]. В настоящей работе методом ГЖХ было продолжено изучение жирнокислотного состава липидов вакуолей, выделенных из корнеплодов пастернака, корневой петрушки и моркови, устойчивых к низким температурам, а также рас-
смотрены возможные пути биосинтеза ненасыщенных ЖК в липидах вакуолярных мембран.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили вакуоли из запасающих тканей корнеплодов пастернака (Pastinaca sativa L), петрушки корневой (Petroseli-num crispum L.) и моркови (Daucus carota L.), характеризующихся высокой устойчивостью к низким температурам. Ткани корнеплодов нарезали в среде выделения (0.8 M KCl, 20 мМ ЭДТА, 50 мМ Na2HPO4, pH 8.0), и по описанной ранее методике механически выделяли вакуоли с помощью специального аппарата [9]. Выход вакуолей из тканей корнеплодов составлял 107-108 вакуолей/кг ткани [9, 13, 29].
Суспензию выделенных вакуолей отделяли от измельченной ткани и центрифугировали в течение 10 мин при 250 g. Осадок ресуспендирова
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.