БИОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ ПОЧВ
УДК 631.46-576.8
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ БАКТЕРИЙ В ТОРФЯНИКАХ*
© 2014 г. О. Ю. Богданова1, А. В. Головченко1, Л. В. Лысак1, Т. В. Глухова2, Д. Г. Звягинцев1
Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы
e-mail: golovchenko.alla@gmail.com 2Институт лесоведения РАН, 143030, с. Успенское, Одинцовский р-н Московская обл.
e-mail: root@ilan.ras.ru Поступила в редакцию 28.03.2013 г.
Люминесцентно-микроскопическим методом с помощью флуоресцентного двухкомпонентного красителя L7012 LIVE/DEAD определена жизнеспособность бактерий в толще верховых и низинных торфяников. Живые клетки бактерий обнаружены по всему профилю. Их доля была максимальной в верхних слоях — 60% и не превышала 25% в нижней толще. На долю мертвых клеток бактерий приходилось от 3 до 19%, а на долю покоящихся клеток — от 25 до 95%. Количество последних увеличивалось вниз по профилю независимо от типа торфяника. Доля наноформ не превышала 5% от общей численности бактерий. Клетки наноформ в отличие от бактерий обычных размеров характеризовались высокой жизнеспособностью (93—98%).
Ключевые слова: торфяники, бактерии, жизнеспособность, люминесцентно-микроскопический метод, наноформы бактерий.
Б01: 10.7868/80032180X14020038
ВВЕДЕНИЕ
Болота и заболоченные земли, занимающие более одной пятой территории России, являются бесценными природными кладовыми микроорганизмов. Об этом свидетельствуют данные прямых микроскопических методов, с помощью которых выявлены большие запасы микробной биомассы в торфяниках. Бактерии, споры грибов и дрожжеподобные клетки были обнаружены по всему профилю, а грибной мицелий — преимущественно в верхней метровой толще [3].
Наиболее дискуссионным и только частично разрешенным является вопрос о состоянии, в котором находятся микроорганизмы в торфяниках, особенно на глубине, где возраст слоев определяется тысячелетиями.
О жизнеспособности бактерий, микромицетов и дрожжей, обнаруженных на разных глубинах вплоть до подстилающей породы торфяника, свидетельствует их способность к росту на питательных средах [3, 6—9, 16]. Выявление прямым методом сезонной динамики показателей обилия микроорганизмов по всему профилю позволяет говорить о реальном размножении части микробного комплекса не только в верхних, но и в нижних слоях торфяника [3, 4].
* Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 13-04-00536.
Жизнеспособные мицелий и споры грибов в торфяниках удалось выявить методом проращивания грибных пропагул [17]. О прорастании спор грибов судили по выбрасыванию ростовой трубки, дрожжеподобных клеток — по почкованию и делению, мицелия — по удлинению гиф и образованию микроколоний. Анализировали верховые торфяники, мощность которых составляла 3 м. Способность к прорастанию у спор и дрожжеподобных клеток отмечали по всему профилю, у мицелия — только в верхней метровой толще. Доля живого мицелия и спор грибов резко убывала с глубиной. В нижней толще торфяников количество проросших спор варьировало от 10 до 40%, а проросшего мицелия не превышало 25% [5].
Аналогичные результаты получены при определении жизнеспособности грибного мицелия после окрашивания препаратов для люминесцентной микроскопии акридином оранжевым и флюоресцеин диацетатом [2, 12].
Таким образом, приходится констатировать факт, что грибы, являющиеся основными деструкторами органического вещества, находятся в жизнеспособном состоянии по всему профилю торфяника. Однако доля живого мицелия и спор грибов резко убывает с глубиной.
Вопрос о жизнеспособности бактерий в торфяниках остается открытым. Определенный вклад в его решение может внести использование
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ БАКТЕРИЙ В ТОРФЯНИКАХ
467
красителя L7012 (LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit), который позволяет учесть не только общую численность бактерий, но и определить соотношение "живых" и "мертвых" клеток [27].
Известно, что краситель успешно применялся для определения общей численности бактерий и количественного учета живых бактерий в почвах [13, 14], естественных водных объектах [23, 24], пробиотических продуктах питания [21], в сильно-засоленных местах обитания [26]. В почвах доля жизнеспособных клеток в верхних горизонтах составляет около 60%, в нижних — 20—30% [13, 14].
Цель нашего исследования — определение жизнеспособности бактерий в верховых и низинных торфяниках с помощью красителя L7012.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования были торфяники, являющиеся постоянными пробными площадями Западнодвинского лесоболотного стационара Института лесоведения РАН в Тверской обл. (56°09' с.ш., 32°10' в.д. и 56°09' с.ш., 32°08' в.д.).
Один из верховых торфяников (здесь и далее "верховой торфяник 1") является частью грядо-во-мочажинного сфагнового безлесного болота "Петрилово". Отложения болот представлены торфом, возраст которого составляет 8590 ± 179 лет; подстилаются органо-минеральным сапропелем. Залежь сложена верховым торфом: до 2 м — слабо-разложившимся (3—15%); от 2 до 3 м — среднераз-ложившимся (25—35%) (табл. 1). Величина рН варьирует сверху вниз по профилю от 2.7 до 4.3.
Другой из верховых торфяников (здесь и далее "верховой торфяник 2") находится на территории торфяного массива "Сосвятское" под сосняком андромедово-пушицево-сфагновым. Этот массив более дренирован, чем болотный массив "Петрилово" и соответственно характеризуется более высоким круговоротом веществ. Отложения болот представлены торфом, возраст которого не превышает 10 тыс. лет; подстилаются в различной степени оглеенными песками. Залежь сложена верховым торфом до 1.5 м — слаборазложившим-ся (3—20%); от 1.5 до 3 м — среднеразложившимся (25—35%). Величина рН варьирует по профилю от 2.8 до 4.5.
Низинный торфяник расположен на территории торфяного массива эвтрофного типа "Грустинка" под сосняком болотно-травяным. Торфяная толща, сложенная низинными торфами со степенью разложения 35—47%, подстилается ор-гано-минеральными отложениями с растительными остатками. Величина рН варьирует в зависимости от вида торфа от 5.6 до 6.0.
Образцы торфа для микробиологического анализа были отобраны в августе 2011 г. Во всех образцах осуществляли контроль влажности.
Численность и жизнеспособность бактерий определяли люминесцентно-микроскопическим методом с помощью флуоресцентного двухком-понентного красителя L7012 (LIVE/DEAD Bac-Light bacterial viability kit.) [27]. Краситель состоит из двух компонентов: Syto9 (изотиоцианат флуо-ресцеина) и PI (пропидиум йодида). Syto9 проникает в клетки бактерий как с неповрежденными, так и поврежденными мембранами. Компонент PI проникает только в клетки с поврежденными мембранами, вызывая уменьшение флюоресценции Syto9. При использовании этого красителя, клетки бактерий с целостными мембранами (живые) флюоресцируют зеленым цветом, а клетки с поврежденными мембранами (мертвые) — красным цветом [25]. Подготовку препаратов торфяной суспензии для дальнейшего окрашивания и просмотра под люминесцентным микроскопом осуществляли по методике, приведенной в пособии [11]. Подготовку красителя и окраску препарата производили согласно рекомендациям производителя [25].
Дополнительно в исследуемых образцах торфа определяли численность бактерий с помощью традиционного красителя для прокариотных микроорганизмов — акридина оранжевого [15].
Для обнаружения наноформ бактерий в слоях Т0 (6-10 см), Т1 (10-14 см) и Т2 (14-30 см) верхового торфяника 2 использовали методику, включающую выделение бактериального комплекса из почвенной суспензии с последующей фильтрацией проб через ядерные мембранные фильтры фирмы с размером пор
0.22 мкм (220 нм) и концентрированием полученного фильтрата центрифугированием [14]. Принадлежность клеток бактерий, полученных при помощи этого метода, к наноформам подтверждена при изучении их морфологии и размеров в просвечивающем электронном микроскопе. Подавляющая часть клеток имела диаметр от 120 до 200 нм и длину не более 300-400 нм (реже 500600 нм) [18].
Численность и жизнеспособность наноформ бактерий так же, как и бактерий, определяли лю-минесцентно-микроскопическим методом с помощью красителя L7012 [25].
Расчеты численности бактерий (наноформ бактерий) в 1 г торфа проводили по общепринятой методике, используемой при работе с акридином оранжевым [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общая численность бактерий, установленная с помощью красителя L7012, варьировала от 2 до 24 млрд кл./г сухого торфа, а выявленная акридином оранжевым — от 4 до 54 млрд кл./г в зависимости от глубины и типа торфяника. Большие по-
Таблица 1. Ботанический состав и степень разложения торфа в различных слоях исследуемых торфяников
Глубина, см Ботанический состав Степень разложения торфа, %
Верховой торфяник 1
0-5 Фускум 3
5-20 Комплексный верховой 5
20-50 Фускум 7
50-100 Комплексный верховой 7
100-150 Магелланикум 10
150-200 Комплексный верховой 15
200-225 Магелланикум 25
225-250 » 25
250-275 Сосново-сфагновый верховой 35
275-300 » 35
Верховой торфяник 2
0-2 Магелланикум 3
2-4 » 3
4-8 » 3
8-15 » 5
15-25 » 10
25-50 » 20
50-100 Комплексный верховой 15
100-150 » 20
150-200 » 30
200-250 Магелланикум 25
250-300 Пушицево-сфагновый верховой 35
Низинный торфяник
0-2 Древесно-осоковый низинный 35
2-4 » 35
4-8 » 35
8-15 » 35
15-25 Древесный низинный 47
25-50 » 43
50-100 » 40
100-150 » 45
150-200 » 43
200-250 » 45
казатели обилия бактерий, которые дает акридин оранжевый, могут быть связаны с его химической природой. Являясь катионным красителем, он адсорбируется на поверхности частиц торфа, что может привести к завышению численности бактерий при подсчете клеток. Изотиоцианат флуо-ресцеина, входящий в состав Ь7012, является анионным красителем и имеет низкий уровень связывания с неклеточными структурами, что дает ему преимущество в получении репрезентатив-
ных данных относительности численности бактерий в торфах.
Следует сказать, что показатели обилия бактерий, полученные при окрашивании препаратов акридином оранжевым, были в 2—4 раза выше, чем при окраске Ь7012 только в верхней толще исследуемых торфяников. В глубоких слоях различ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.