ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 5, с. 580-588
ФИЗИОЛОГИЯ животных И ЧЕЛОВЕКА
УДК 616.001.16-092.17
ЗНАЧЕНИЕ кгОПИОИДНЫ1Х РЕЦЕПТОРОВ И цАМФ В РЕГУЛЯЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА К ДЕЙСТВИЮ
ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ
© 2008 г. Т. В. Ласукова*,**, Л. Н. Маслов*, А. А. Платонов*, Н. В. Гузарова*, Ю. Б. Лишманов*
* Научно-исследовательский институт кардиологии СО РАМН, 634050 Томск, ул. Киевская, 111 ** Томский государственный педагогический университет, 634050 Томск, просп. Комсомольский, 75
E-mail: maslov@cardio.tsu.ru Поступила в редакцию 21.07.2006 г.
Исследовали кардиопротекторный, инотропный и антиаритмический эффекты селективного аго-ниста к1-опиоидных рецепторов (к1ОР) U-50.488 на модели 45-минутной тотальной ишемии и 30-минутной реперфузии изолированного перфузируемого сердца крысы. Стимуляцию кардиальных к1ОР проводили путем добавления U-50.488 в перфузионный раствор в конечной концентрации 0.1 и 1 мкмоль/л. Опиоид не оказывал эффекта на частоту возникновения реперфузионных аритмий. Применение U-50.488 в конечной концентрации 0.1 мкмоль/л приводило к уменьшению реперфузи-онного выброса креатинфосфокиназы (КФК) в 2 раза, которое положительно коррелировало со снижением миокардиального уровня цАМФ (r = 0.89, p < 0.01). Применение U-50.488 в конечной концентрации 1 мкмоль/л не оказало эффекта на содержание цАМФ и выброс КФК. Полученные результаты позволяют предполагать, что кардиопротекторный эффект U-50.488 связан с уменьшением уровня цАМФ в клетках сердца. Активация к1ОР вызвала снижение частоты и силы сокращений миокарда. Доказано, что отрицательный инотропный и хронотропный эффект U-50.488 не зависит от изменения содержания цАМФ в миокарде. Выдвигается гипотеза о том, что отсутствие кардиопротекторного эффекта у U-50.488 в конечной концентрации 1 мкмоль/л является результатом активации неопиоидных рецепторов кардиомиоцитов.
Известно, что активация опиоидных рецепторов (ОР) обеспечивает повышение устойчивости миокарда к повреждающему действию ишемии и реперфузии (Лишманов и др., 1997, 2000; Chien et al., 1999). Проведенные нами ранее исследования показали, что стимуляция ц- и 8-ОР сопровождается снижением частоты возникновения реперфузионных аритмий, увеличением выживаемости кардиомиоцитов при ишемии-реперфузии (Лишманов и др., 1997, 2000). Профилактическое применение агонистов ц-ОР в значительной степени предотвращает формирование реперфузи-онной сократительной дисфункции миокарда (Ласукова и др., 2001). В то же время, имеющиеся в литературе данные о роли кОР в регуляции сердечной деятельности неоднозначны и противоречивы. Одни исследователи отмечают кардиопро-текторное действие селективных к-агонистов в условиях коронароокклюзии и реперфузии in vivo (Peart et al., 2004). Согласно данным других авторов (Aitchison et al., 2000), агонист к2-рецепторов бремазоцин, напротив, способствует усугублению ишемических и реперфузионных повреждений сердца in vitro. Сведения об участии к-опиоид-ных рецепторов в аритмогенезе также противоречивы. Имеются публикации как об
антиаритмической активности к-агонистов (Yu et al., 1999; Маслов и др., 2005) так и сообщения об их аритмогенном действии (Bian et al., 2000). Эти разногласия могут быть связаны с существованием на сарколемме кардиомиоцитов двух субтипов к-рецепторов: к1 и к2 (Zhang et al., 1996). Так, авторы, отмечающие кардиопротекторный эффект опиоидов, использовали агонисты к1ОР (Wu et al., 1999; Peart et al., 2004), а усиление ише-мического и реперфузионного повреждения сердца исследователи наблюдали после применения агониста к2-рецепторов (Aitchison et al., 2000). Имеются доказательства в пользу участия кОР в регуляции насосной функции миокарда, например, в экспериментах на изолированных интакт-ных кардиомиоцитах или изолированных перфу-зируемых препаратах сердца отмечено отрицательное инотропные действие к-агонистов (Clo et al., 1985; Ventura et al, 1992; Fujita et al, 2000). Есть единичные работы о влиянии этих соединений на насосную функцию сердца в условиях ишемии-реперфузии. В исследованиях, выполненных на модели 20-минутной тотальной ишемии, отмечено к-опиоидергическое улучшение сократимости изолированного сердца крыс во время реперфузии (Pyle et al., 2000). С другой стороны, име-
ются данные об отсутствии инотропного эффекта к-агонистов в условиях локальной ишемии и реоксигенации миокарда (Aitchison et al., 2000). Таким образом, на сегодняшний день нет единого мнения в вопросе о роли к-рецепторов в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии.
Внутриклеточные механизмы кардиотропных эффектов лигандов кОР также изучены недостаточно. Известно, что активация кОР приводит к ингибированию аденилатциклазы и угнетению образования цАМФ в интактных кардиомиоци-тах (Yu et al., 1998). В этой связи следует отметить, что некоторые авторы связывают кардио-протекторное действие, оказываемое опиоидами в условиях моделирования ишемии-реперфузии сердца, со снижением уровня цАМФ в миокарде в ответ на стимуляцию ОР (Aitchison et al., 2000). Опираясь на эти литературные данные, мы предположили, что цАМФ может играть важную роль в реализации кардиотропных эффектов к1-агони-стов на модели тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца.
Целью нашей работы явилось: а) исследование роли к1ОР в регуляции устойчивости изолированного сердца к действию ишемии и реперфузии; б) оценка вклада цАМФ в реализацию кардиотропных эффектов к1-агониста U-50.488 in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на изолированных сердцах крыс-самцов линии Вистар массой 250300 г, наркотизированных этиловым эфиром. После извлечения сердца из грудной клетки его быстро переносили в ванночку с охлажденным (4°С) раствором Кребса-Хензелайта для прекращения спонтанных сокращений, а затем помещали в термостатируемую увлажненную камеру. В восходящую дугу аорты вводили канюлю, через которую выполняли ретроградную перфузию сердца раствором Кребса-Хензелайта по методу Лангендорфа под постоянным давлением 52 мм рт. ст. Для приготовления оксигенированного перфузионного раствора (37°С, рН 7.4), содержащего: NaCl 120 ммоль/л; KCl 4.8; CaCl2 2.0; MgSO4 1.2; KH2PO4 1.2; NaHCO3 20.0; глюкоза 10.0 мМ, применяли реактивы компании ICN "Biomedicals" (США). Тотальную нормотермическую ишемию миокарда моделировали посредством полного прекращения подачи перфузионного раствора на 45 мин. После этого возобновляли коронарную перфузию и продолжали наблюдение в течение 30 мин. В первые 10 мин реперфузии регистрировали электрокардиограмму (ЭКГ) с помощью электродов, расположенных на правом предсердии и левом желудочке. При анализе ЭКГ учитывали появление желудочковых аритмий (экстрасистол, тахикардии и фибрил-
ляции). Регистрацию сократимости сердца осуществляли в изоволюмическом режиме с помощью электроманометра, сопряженного с ла-тексным баллончиком, помещенным в полость левого желудочка.
Стимуляцию кхОР проводили с помощью селективного агониста названных рецепторов U-50.488 (trans(±)-3,4-Dichloro-N-methyl-N-[2-(1-pyrrolidinyl)cyclohexyl] benzeneacetamide hydrochloride) (Lahti et al., 1985). Для этого по окончании 20 мин адаптации сердца к условиям нормок-сической перфузии и за 20 мин до моделирования ишемии-реперфузии в раствор Кребса-Хензелайта добавляли U-50.488 в конечной концентрации 0.1 и 1 мкмоль/л. После 10-минутной перфузии с препаратом сердце "отмывали" от лиганда в течение еще 10 мин. Продолжительность последующей тотальной ишемии составила 45 мин, а реперфузии - 30 мин. При использовании U-50.488 в концентрации 0.1 мкмоль/л мы руководствовались данными о том, что константа ингибирова-ния (K;) этого соединения, характеризующая его сродство к кхОР, составляет 32 нМ (0.032 мкМ) (Ela et al., 1997). Основанием для применения U-50.488 в концентрации 1 мкмоль/л послужили данные литературы об антиаритмическом эффекте этого к1-агониста на модели норадрена-лин-индуцированных аритмий in vitro (Yu et al., 1999). Препарат U-50.488 растворяли в физиологическом растворе непосредственно перед началом эксперимента. Контролем служили изолированные сердца, которые после 40 мин стабилизационного периода подвергали 45 мин тотальной ишемии и 30 мин реперфузии.
В ходе эксперимента регистрировали следующие показатели: частоту сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин); давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ, мм рт. ст.); конечное диастоли-ческое давление (КДД). Давление, развиваемое левым желудочком, вычисляли как разницу между систолическим и диастолическим давлением. Кроме того, определяли максимальную скорость сокращения (МСС, мм рт. ст./мин) и максимальную скорость расслабления сердца (МСР, мм рт. ст./мин). Степень повреждения кардиомиоцитов оценивали по уровню креатинфосфокиназы (КФК) в оттекающем от сердца перфузате. Активность КФК определяли с помощью энзиматических наборов CK-NAc компании "Biocon Diagnostik" (Германия) и пересчитывали на 1 г ткани сердца за 30 мин реперфузии. Конечный результат выражали в U/г, где U - мкмоль NADH/мин.
Содержание цАМФ в ткани миокарда определяли до ишемии на 30-й мин нормоксической перфузии изолированного сердца и после ишемии на 30-й мин реперфузии. В указанные сроки изолированные сердца быстро замораживали и хранили в жидком азоте. Для определения уровня
уд./мин
300 г
250 200 150 100 50 0
(а)
# ##
-♦—
##*
мм рт. ст. 90 80 70 60 50 40 30 20 10
0
%
350 300 250 200 150 100 50 0
(б)
##* ##*
##*
(в)
## ## ##
Ишемия
0
10
20
5
15
30
Перфузия, мин
Реперфузия, мин
Рис. 1. Влияние агониста к1-опиоидных рецепторов ^50.488 на частоту сердечных сокращений (а), давление, развиваемое левым желудочком (б) и конечное диастолическое давление, выраженное в % от исходных показателей (в). 1 - контроль; 2 - ^50.488 в концентрации 0.1 мкмоль/л; 3 - ^50.488 в концентрации 1 мкмоль/л (для рис. 1, 2). Достоверные отличия от контроля: * -р < 0.05; отличия от значений до ишемии: # -р < 0.05; ## -р < 0.01 (для рис. 1, 2, 4).
цАМФ проводили экстракцию последнего из ткани сердца этиловым спиртом (Maslov, Lishmanov, 1995). В полученных образцах иссл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.