ОПТИКА И СПЕКТРОСКОПИЯ, 2015, том 118, № 3, с. 520-527
ГЕОМЕТРИЧЕСКАЯ И ПРИКЛАДНАЯ ОПТИКА
УДК 611.018.26.085.23:577.344.3
АНАЛИЗ ОПТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК in vitro ЖИРОВОЙ ТКАНИ, СЕНСИБИЛИЗИРОВАННОЙ ИНДОЦИАНИНОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ, ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИК ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ © 2015 г. И. Ю. Янина***, В. А. Дубровский*, В. В. Тучин*********
* Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, 410012 Саратов, Россия ** Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, 410012 Саратов, Россия *** Институт проблем точной механики и управления РАН, 410028 Саратов, Россия **** Университет Оулу, Финляндия E-mail: irina-yanina@list.ru Поступила в редакцию 26.09.2014 г.
Исследовано влияние лазерного ИК излучения на сенсибилизированную индоцианиновым зеленым (ИЗ) жировую ткань in vitro. Экспериментально и статистически показано, что селективное по длине волны облучение ткани приводит к последействию, а именно к увеличению однородности оптических изображений жировых клеток со временем. В то же время обнаружено, что среднее по площади изображения ткани значение коэффициента пропускания слабо зависит от времени наблюдения. Увеличение степени однородности изображений трактуется как результат иммерсии оптических неоднородностей ткани за счет содержимого клеток, вытекающего через образованные под действием фотохимического эффекта поры в мембранах клеток. С другой стороны, установлено, что увеличение степени оптической однородности среды компенсируется уменьшением коэффициента пропускания самого сенсибилизатора, что проявляется в слабой зависимости усредненного по изображению "просветления" образца ткани от времени наблюдения.
DOI: 10.7868/S0030403415030241
1. ВВЕДЕНИЕ
Исследованию фотодействия на сенсибилизированные биоткани посвящено немало работ [1—3]. Так, измерение оптических свойств сенсибилизированных тканей позволяет определять эффективность связывания молекул красителя-фото -сенсибилизатора (ФС) с клетками эпидермиса [4—6], волосяными фолликулами [6, 7] или опухолевыми клетками [8, 9]. В работах [10, 11] подобные исследования направлены на определение концентрации ФС в ткани, что важно для проведения фотодинамической терапии.
В то же время, несмотря на многочисленные исследования в области оптики биотканей [12, 13], оптические параметры окрашенной и селективно облученной жировой ткани остаются в настоящее время малоизученными. Знание этих параметров для жировой ткани является принципиально важным для обеспечения хорошо контролируемой послойной лазерной деструкции ткани при лечении ожирения и целлюлита [14—20].
Ранее было показано [21—23], что облучение световыми источниками (диодная лампа или ИК лазер) жировой ткани, сенсибилизированной бриллиантовым зеленым (БЗ) или индоцианиновым зеленым (ИЗ), приводит к изменению мор-
фологии ткани, что, в частности, проявляется в изменении ее оптических свойств. Просветление и пространственное выравнивание оптического пропускания сенсибилизированной БЗ жировой ткани при селективном ее облучении видимым светом наблюдалось в работах [21, 22]. Статистический анализ этого эффекта в работах [24, 25] привел авторов к выводу о возможном механизме фотодинамического действия на сенсибилизированную БЗ жировую ткань в виде липолиза жировых клеток без их полной или частичной деструкции. Эта гипотеза в значительной мере нашла свое подтверждение в работах [26, 27], где на мембранах сенсибилизированных жировых клеток экспериментально были обнаружены некие "образования", которые трактовались авторами как капельки внутриклеточной жидкости, вытекающей через поры в мембране. Исследования просветления сенсибилизированной и облученной жировой ткани при различных экспериментальных условиях, а также найденный довольно высокий уровень коэффициента корреляции между поведением оптического пропускания ткани и подсчитанным количеством "образований" (пор) [27] свидетельствуют о правильности предложенного в работе [26] механизма селективного фото-
Рис. 1. Спектральные характеристики сенсибилизированного образца жировой ткани и источника излучения: сенсибилизатор ИЗ (1) и диодный лазер LS-2-N-808 - 10000 (2).
воздействия на сенсибилизированную жировую ткань.
Аналогичные экспериментальные исследования были проведены при сенсибилизации жировой ткани ИЗ, в качестве источника излучения служил инфракрасный лазер [21, 22]. Однако в отличие от БЗ статистическая обработка результатов показала [28], что в случае применения ИЗ общего просветления образца ткани не происходит, а имеет место лишь выравнивание его оптического пропускания по площади слоя жировой ткани. Кроме того, регистрация пор в мембранах жировых сенсибилизированных и селективно облученных клеток была реализована лишь для БЗ в качестве ФС, для красителя ИЗ подобное формирование пор в мембранах не исследовалось.
Цель настоящей работы заключается в экспериментальном подтверждении возникновения пор в мембранах жировых клеток под действием ИК лазерного излучения при их сенсибилизации ИЗ, исследовании кинетики оптических характеристик жировой ткани in vitro в условиях фотохимического воздействия, а также выявлении механизмов управления оптическими свойствами жировой ткани.
2. МАТЕРИАЛЫ И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Объектом исследования служила подкожная жировая ткань женщины в возрасте 42 лет и весом 85 кг, извлеченная при пластической операции. Изучение жировых клеток проводилось in vitro.
После замораживания с помощью микротомного ножа делались срезы ткани. Толщина срезов составляла 150—200 мкм, размер образца порядка 2—3 мм, среднее количество клеток на поверхности среза около 40—60 штук. Затем приготовленный образец помещался на предметное стекло и окрашивался в течение 10 мин.
В экспериментах использовались 1%-ный спиртово-водный раствор ИЗ (1 мг/мл).
Затем образец помещался на столик микроскопа БИОЛАМ П2-1 (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия), который термостабилизировался с помощью жидкостного термостата ТЖ-ТС-01, его температура изменяется в пределах +20—+ 150°С с точностью ±0.1 °С (Аналит-Нева, Санкт-Петербург). К окуляру микроскопа присоединялась ССD-ка-мера (USB-камера для микроскопа DCM500, Компания Hangzhou Scopetek Opto-Electric Co., Ltd., Китай), подключенная к персональному компьютеру. Через 15 мин, когда температура образца достигала требуемой величины в диапазоне от 25 до 50°C, проводилась регистрация изображений образца в проходящем свете. Далее жировая ткань в течение заданного времени облучалась излучением диодного лазера LS-2-N-808 —10000 (X = 808 нм) (ООО ЛаС, Санкт-Петербург). Излучение с помощью световода передавалось на образец биоткани, на поверхности которого обеспечивалась плотность мощности 250 мВт/см2 при диаметре светового пятна в 1 мм. Длительность облучения варьировала в пределах 0.5—1.5 мин. Эффективность фотовоздействия обеспечива-
& М/я ■рз
! ■ VLH
Г ш (а) Sr - 's (б) ~ / У (в) * (г) (д) (е)
Рис. 2. Оптические изображения окрашенного ИЗ образца жировой ткани после воздействия ИК лазерного излучения (808 нм) для разных времен наблюдения, t, мин: а — сразу после облучения, t = 0, б — t = 10, в — t = 16, г — t = 26, д — t = 30, е — t = 37. Объектив микроскопа 6.3*. Температура жировой ткани 41°С.
лась совпадением спектра излучения лазера со спектром поглощения ИЗ (рис. 1). Инструментом для изучения влияния света на жировую ткань in vitro являлась периодическая регистрация цифровых изображений образца ткани в проходящем свете от источника белого света по окончании облучения ее лазерным излучением.
Изображения области образца, попадающие в поле зрения микроскопа, регистрировались до облучения ткани лазером, а затем после облучения в виде серии цифровых изображений через равные промежутки времени с периодом около 5 мин. При обработке полученных изображений учитывалась световая характеристика камеры, вопросы калибровки камеры рассматривались в работе [29].
В зависимости от решаемых задач в работе использовались 6.3- и 90-кратные объективы: в первом случае в поле зрения оказывалось порядка 100 клеток, во втором — приблизительно одна клетка.
Программное обеспечение для поддержки работы CCD-камеры включает программу Aver Media EZ Capture для управления камерой в ОС семейства Windows. Запись файлов изображений на диск осуществляется в формате BMP (Windows Bitmap).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Оптические характеристики
Эффект изменения оптических свойств сенсибилизированной ИЗ, а затем селективно облученной жировой ткани при температуре 41 °С иллюстрируется на рис. 2 в виде серии изображений для различных моментов времени.
Из рис. 2 видно, что а) с течением времени оптическое пропускание образца T выравнивается по площади изображения, б) выравнивание T по площади изображения осуществляется преимущественно за счет изменения оптических свойств межклеточного пространства [30], в) сравнение изображений и в особенности рис. 2д и рис. 2е позволяют предположить, что средняя по площади яркость изображений не зависит от времени
анализа £ в разделе 3.2.1 это найдет свое подтверждение количественно.
Каждое цифровое изображение можно рассматривать как статистическую выборку яркости B (или оптического пропускания образца Т), количество элементов которой равно количеству пикселей данного изображения. Методика расчета оптического пропускания ткани Т и яркости В описана в [31] и использована в ряде работ [27, 28].
Таким образом, каждое из изображений на рис. 2 для любого момента времени (а—е) можно рассматривать как статистическую выборку в виде массива экспериментальных данных.
Результаты статистической обработки изображений для одной из 5 зон образца ткани при окраске ИЗ представлены на рис. 3. Эксперименты были проведены на 5 образцах биоткани, так что общее количество зон составляло 25, а с учетом исследования изображений в динамике общее количество анализируемых изображений составило около 375.
Аналогичные зависимости для усредненного по анализируемой поверхности образца пропускания Т (^ и Т (^ ± 3аТ (0 наблюдались и для других зон образцов ткани, что свидетельствует о хороше
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.