ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 612.822.56
ДЕГЕНЕРАЦИЯ НИГРОСТРИАТНЫХ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ
НЕЙРОНОВ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ РАННЕЙ КЛИНИЧЕСКОЙ СТАДИИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА © 2014 г. А. А. Колачева1, *, Е. А. Козина12, Е. В. Волина1, М. В. Угрюмов12
1Лаборатория нервных и нейроэндокринныхрегуляций, Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
2Лаборатория нейрогистологии им. Б.И. Лаврентьева, Институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН
В основе патогенеза болезни Паркинсона (БП) лежит прогрессирующая дегенерация дофаминерги-ческих нейронов нигростриатной системы мозга. Важнейшим направлением терапии БП является использование лекарственных веществ, замедляющих гибель нейронов. Поэтому цель данной работы — адаптация разработанной модели ранней клинической стадии БП на мышах [1] для ее дальнейшего использования в качестве тест-системы при поиске потенциальных нейропротекторов. Согласно полученным данным, дегенерация тел дофаминергических нейронов в черной субстанции (ЧС) начинается через 3 ч после последней инъекции 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), тогда как число дофаминергических аксонов в стриатуме к этому времени уже значительно снижено. Деградация аксонов и тел нейронов продолжается в последующие 3 ч. Этот период времени представляется оптимальным для тестирования нейропротекторов, поскольку в дальнейшем число тел нейронов в ЧС и аксонов в стриатуме не меняется. При разработке тест-системы важно было оценить функциональное состояние сохранившихся нейронов. Показано, что через 3 ч после последней инъекции МФТП содержание дофамина (ДА) в ЧС падает до 25% от контроля, а далее оно увеличивается и через 24 ч достигает 70%. Количество тирозингидроксилазы в телах нейронов в течение всего исследуемого периода времени остается на уровне контроля. В стриатуме концентрация ДА снижена на 90% через 3 ч после последней инъекции МФТП и на последующие сроки не меняется, при этом содержание тирозингидроксилазы постепенно снижается к 12 ч. Полученные данные, вероятно, свидетельствуют о компенсаторном увеличении активности тирозингидроксилазы как в ЧС, так и в стриатуме. Таким образом, у мышей на модели ранней клинической стадии БП было показано, что дегенерация нигростриатных дофаминергических нейронов заканчивается через 14 ч после начала действия специфического нейротоксина, что сопровождается включением компенсаторных процессов, направленных на усиление ДА-й нейротрансмиссии.
Ключевые слова: мозг, дофамин, черная субстанция, стриатум, тирозингидроксилаза, болезнь Паркинсона, нейротоксин, МФТП.
Б01: 10.7868/81027813314030078
ВВЕДЕНИЕ
В основе патогенеза болезни Паркинсона (БП) лежит дегенерация дофаминергических (ДА-ер-гических) нейронов нигростриатной системы мозга, тела которых локализованы в компактной части черной субстанции (ЧС), а аксоны проецируются в дорзальный стриатум. Этиология заболевания остается неизвестной, но считается, что факторами риска являются мутации в ряде генов, а также наличие эндогенных и экзогенных токсических веществ, способных вызвать развитие нейродегенеративного процесса. Длительное бессимптомное течение БП объясняют включением
* Адресат для корреспонденции: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26; тел./факс: (499)135-88-42; e-mail: annakolacheva @gmail.com.
компенсаторных процессов в мозге при прогрессирующей дегенерации ДА-ергических нейронов [2]. В настоящее время БП у человека диагностируется только после появления специфических симптомов — нарушения двигательной функции (тремор покоя, ригидность и брадикинезия), что происходит при гибели порогового количества ДА-ергических нейронов (50—60%) и истощения компенсаторных резервов мозга [3].
Лечение больных направлено на снижение нарушений двигательной функции с помощью аго-нистов дофамина (ДА): агонистов рецепторов к ДА, предшественника синтеза ДА — Ь-дигидрок-сифенилаланина (Ь-ДОФА), ингибиторов ферментов деградации ДА, в первую очередь моно-аминоксидаз [4—6]. По мере прогрессирования заболевания необходимо увеличивать дозу си-
стемно вводимых лекарственных веществ, что сопровождается появлением побочных токсических эффектов. Отсюда становится очевидной необходимость поиска эффективных лекарственных средств — нейропротекторов, которые смогут на ранних этапах развития заболевания остановить или, по крайней мере, замедлить гибель ДА-ерги-ческих нейронов. В связи с тем, что доклинической диагностики БП не существует, целесообразно начинать лечение этого заболевания с помощью нейропротекторов на максимально ранней клинической стадии, когда количество нейронов-"мишеней" все еще значительно.
Для поиска потенциальных нейропротекторов необходима тест-система, представляющая собой модель, максимально адекватную патогенезу БП, особенно по динамике дегенерации ДА-ергиче-ских. Наиболее широкое распространение получило моделирование БП с помощью предшественника нейротоксина ДА-ергических нейронов, структурного аналога ДА, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП). МФТП после системного введения проникает через ге-матоэнцефалический барьер, быстро превращается в токсин — 1-метил-4-фенилпиридин ион (МФП+), который захватывается в ДА-ергиче-ские нейроны с помощью мембранного переносчика ДА, что объясняет высокую селективность его действия. Помимо влияния на катехолами-нергические нейроны мозга МФТП оказывает токсическое действие и на периферические ка-техоламинергические нейроны [7], что сопровождается нарушением функций висцеральных органов. Другими словами, с помощью МФТП моделируется не только патология мозга, но и периферических органов, что соответствует современным представлениям о БП как о системном заболевании [8—10].
Недавно была разработана модель ранней клинической стадии БП на мышах с использованием МФТП, которая, однако, была охарактеризована только через две недели после введения токсина, т.е. после того как дегенерация нейронов уже завершилась [11], но в разгар развития компенсаторных процессов [1, 12—14]. Очевидно, что в таком виде эта модель не может быть использована в качестве тест-системы для поиска потенциальных лекарственных веществ с нейропротекторны-ми свойствами. Поэтому цель данного исследования — оценка динамики дегенерации ДА-ергиче-ских нейронов и метаболизма ДА в сохранившихся ДА-ергических нейронах на модели ранней клинической стадии БП для ее дальнейшего использования в качестве тест-системы при поиске потенциальных нейропротекторов. Для достижения поставленной цели предполагалось оценить:
1) период дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы после введения МФТП,
2) динамику деградации тел ДА-ергических ней-
ронов в ЧС и терминалей их аксонов в стриатуме, 3) динамику изменения уровня ДА и 3,4-диокси-фенилуксусной кислоты (ДОФУК) — ближайшего продукта деградации ДА в ЧС и в стриатуме в период дегенерации нейронов и несколько позднее; 4) динамику изменения содержания тирозин-гидроксилазы (ТГ) — ключевого фермента синтеза ДА, ДА и ДОФУК в отдельных телах нейронов в ЧС и в терминалях аксонов в стриатуме в период дегенерации нейронов и несколько позднее.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. В данной работе использовали мышей линии С57В1/6 в возрасте 2—3 мес. весом 22— 26 г. Модель ранней клинической стадии БП воспроизводили путем 4-кратного подкожного введения МФТП (Sigma, США) в разовой дозе 12 мг/кг с интервалом между введениями 2 ч. Животным контрольной группы вводили 0.9% NaCl по аналогичной схеме. Для морфологического исследования в контроле и в опыте на каждом выбранном сроке после последней инъекции МФТП было использовано по 4 животных, а для биохимического исследования — по 10 животных. Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по охране животных Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, находящимся в соответствии с национальными и международными этическими законами.
Получение материала. Для морфологического исследования через 3, 6, 12 и 24 ч после последней инъекции МФТП мышей наркотизировали хлоралгидратом (12.5 мг/кг) (Sigma, США) и перфу-зировали 15 мин фосфатно-солевым буфером (0.9% NaCl на 0.02 М фосфатном буфере, рН 7.2— 7.4) (ФСБ), а затем 15 мин 4% параформальдеги-дом на 0.2 М фосфатном буфере (ФБ). Затем мышей декапитировали, извлекали мозг и помещали в тот же фиксатор на 12 ч при +4°C. Далее мозг промывали в 0.02 М ФСБ, помещали в 20% сахарозу на 0.02 М ФСБ на 48 ч для криопро-текции, замораживали в гексане при -40 °C и хранили при —70°C до дальнейшей обработки для иммуноцитохимического выявления ТГ - маркера ДА-ергических нейронов.
Для биохимического анализа мышей через 3, 6, 12 и 24 ч после последней инъекции МФТП наркотизировали хлоралгидратом (12.5 мг/кг), де-капитировали, извлекали мозг и разрезали его по средней сагиттальной плоскости. Из левой половины выделяли стриатум и черную субстанцию (ЧС) согласно атласу [15]. Кусочки взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при —70° C до последующего определения содержания ДА и ДОФУК с помощью ВЭЖХ с электрохимической детекцией.
Иммуногистохимия и анализ изображений. На криостате (Leica, Германия) делали фронтальные серийные срезы ЧС толщиной 20 мкм (от bregma 2.54 до bregma 4.04), а также фронтальные срезы стриатума толщиной 12 мкм (от bregma 1.70 до bregma 0.14). На каждое стекло монтировали каждый срез ЧС и каждый третий срез стриатума от животных в опыте и в контроле.
Срезы на стеклах последовательно инкубировали: (а) с 3% БСА (Sigma, США) и 0.3% Тритоном X100 (Triton-X100, Sigma, США) в ФСБ 30 мин при 20°С; (б) с антителами кролика к ТГ (1 : 2000) (предоставлены профессором Ж. Тибо, Франция), 1% БСА и 0.1% Тритоном X-100 в ФСБ в течение 20 ч при 20°С; (в) с биотинилированны-ми антителами козы к антителам кролика (1 : 200) (Vector Laboratories, США) в ФСБ в течение 2 ч при 20°С; и (г) с авидин-биотиновым комплексом, связанным с пероксидазой хрена (Vector Laboratories, США) в ФСБ в течение 1 ч при 20°C. После каждой инкубации, за исключением первой, срезы промывали в ФСБ в течение 30 мин при 20°С.
Пероксидазу авидин-б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.