НЕИРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 3, с. 213-219
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.352
ДИНАМИКА ИЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ГИППОКАМПЕ И НЕОКОРТЕКСЕ КРЫС ПОСЛЕ ТЯЖЕЛОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ
© 2009 г. М. С. Кислин, Е. И. Тшлькова*, М. О. Самойлов
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург
Исследовано влияние тяжелой гипобарической гипоксии и последующей реоксигенации на уровень и динамику свободно-радикального окисления липидов в гиппокампе, неокортексе крыс и обогащенной митохондриями фракции неокортекса. Показано, что тяжелая гипобарическая гипоксия вызывает долгосрочные изменения системы перекисного окисления липидов в структурах головного мозга наиболее чувствительных к гипоксическим воздействиям (гиппокамп, неокортекс).
Ключевые слова: тяжелая гипобарическая гипоксия, реоксигенация, перекисное окисление липидов, гиппокамп, неокортекс.
В центральной нервной системе ряд ферментов, включающих митохондриальные оксидазы, ксантиноксидазу, миелопероксидазы, цитохром Р450 цитоплазмы и моноаминоксидазу, циклоок-сигеназы (COXs), липооксигеназы (LOXs), NO-синтазу, и NADPH-оксидазу плазматической мембраны, утилизируют молекулярный кислород, продуцируя свободные радикалы в нормальных физиологических условиях [1]. Образовывающиеся при различных патологических воздействиях активные формы кислорода (АФК) способны инициировать и активировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), являющиеся одним из механизмов, ответственных за модификацию состава и физико-химических свойств мембран, с которыми связаны практически все процессы, протекающие в структурах ЦНС, определяющие ее чувствительность к внешним и внутренним факторам. При физиологических условиях ПОЛ участвует в поддержании структурной целостности, функциональной пластичности мембран и в обеспечении работы ионных каналов, рецепторов и ферментов. Важная роль ПОЛ отводится в механизмах синаптической пластичности и в процессах памяти [2]. Уровень ПОЛ зависит от свойств и соотношения про- и антиок-сидантных систем и полноценно отражает функциональное состояние ткани в каждый конкретный момент, ее адаптивные возможности, а также состояние пластичности ее мембран. Изменение уровня ПОЛ характерно для многих физиологических реакций. Вместе с тем выраженные нарушения активности системы ПОЛ вовлекаются в
* Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова. д. 6, тел. (812)595-30-36, e-mail: anoxia@pavlov.infran.ru
механизмы постстрессорных и нейродегенера-тивных патологий [3, 4, 5, 6].
Известно, что тяжелые формы гипоксии/ишемии с последующей реоксигенацией вызывают внутриклеточный оксидативный стресс - мощное усиление свободно-радикальных процессов и ПОЛ [7]. Имеются данные о том, что оксидативный стресс развивается после предъявления гипобарической (высотной) гипоксии [8]. Однако до сих пор отсутствуют сведения о характере развития процесса ПОЛ вслед за тяжелой гипобариче-ской гипоксией.
Целью настоящей работы явилось исследование динамики ПОЛ в наиболее чувствительных к кислородному голоданию образованиях мозга (гиппокампе и неокортексе) в различные периоды времени после предъявления тяжелой гипобарической гипоксии. Особое внимание уделяли изучению характера протекания ПОЛ в митохондриях - клеточных органеллах, обладающих высокой степенью чувствительности к гипоксии и участвующих в механизмах гибели клеток по типу апоптоза [9, 10]. При этом использовали набор методик, полноценно выявляющих динамику процессов ПОЛ (метод определения содержания диеновых и триеновых конъюгантов, липопере-кисей, ТБКАП, оснований Шиффа и оценка степени окисленности мембран по коэффициенту Клейна) [11, 12].
МЕТОДИКА
Эксперименты проведены с соблюдением правил работы с животными, опубликованными Международным Обществом по Нейронаукам ("Guidelines for the Use of Animals in Neuroscience Research", Membership Directory of the Society, 1992).
214
КИСЛИН и др.
Использовали крыс-самцов линии Вистар (весом 200-220 г). Тяжелая гипобарическая гипоксия создавалась в барокамере проточного типа. Крыс "поднимали" на высоту 11000 м (180 мм. рт. ст.) на 3 ч при температуре в барокамере 20-22°С. В качестве контроля использовали крыс, которых в тот же день помещали в барокамеру на 3 ч при нормальном атмосферном давлении.
Животных декапитировали сразу же после воздействия, через 3 ч и через сутки. Все процедуры проводили на льду. Из головного мозга извлекали гиппокамп и фронто-париетальную область коры. Для определения динамики изменений различных компонентов ПОЛ использовали комплекс методов [11, 12]. Ткань мозга гомогенизировали: А - в смеси хлороформ-метанол (2 : 1); Б - в буфере трис-HCl, содержащим KCl (30 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, pH 7.4)
Оставшуюся ткань неокортекса использовали для выделения обогащенной митохондриями фракции экспресс методом по Хаяши [13]. Осадок - тяжелые синаптосомы и митохондрии, обогащенный на 90-95% ресуспензировали в буфера трис-HCl, содержащего KCl, и отбирали пробы на определение продуктов, реагирующих с тиобар-битуровой кислотой (ТБКАП), и на определение содержания белка по Лоури [14], фотометрируя при 780нм. Затем фракцию митохондрий переосаждали и ресуспензировали в смеси хлороформ-метанол (2 : 1).
Из полученных в смеси хлороформ-метанол (2:1) гомогенатов гиппокампа, неокортекса и обогащенной митохондриями фракции неокортекса экстрагировали липиды по методу Фолча [15]. Экстракт отмывали от ганглиозидов и нели-пидных примесей один раз - охлажденным 0.09% NaCl, и дважды - смесью метанол-ЩО-хлоро-форм (47 : 48 : 3).
Количество липоперекисей определяли колориметрическим методом с использованием хлористого алюминия [16], диеновых и триеновых конъюгатов, спектрофотометрически при 233 и 274 нм соответственно [17]. Кроме этого регистрировали оптическую плотность липидного экстракта при 215 нм и рассчитывали индекс Клейна, характеризующего степень окисленно-сти липидов. Также флюориметрическим методом определяли содержание Шиффовых оснований при максимуме возбуждения 365 нм и максимуме испускания 425 нм [18]. Результаты выражали в условных единицах (единицах экс-тинкции или флюоресценции) в расчете на 1 мг фосфолипидов. Количество фосфолипидов оценивали (спектрофотометрически при 830 нм) по содержанию "неорганического" фосфора методом Бартлетта [19].
В буфер трис-HCl гомогенатах гиппокампа, неокортекса и обогащенной митохондриями
фракции неокортекса определяли содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБКАП), фотометрируя при 532 нм [20]. Также учитывался вклад неспецифического поглощения (светорассеяния), который оценивался по величине оптической плотности при 600 нм [21]. Содержание ТБКАП выражалось в условных единицах на 1 мг белка.
Все полученные результаты обрабатывали статистически по правилам вариационной статистики [22, 23]. Различия между величинами считали достоверными при р = 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты исследования представлены в виде гистограмм на рис. 1-3, соответственно для гиппокампа, неокортекса и обогащенной митохондриями фракции неокортекса. Контрольные значения принимали за 100%.
Гиппокамп. В результате 3-часового гипокси-ческого воздействия резко изменилась степень окисленности липидов мембран, которая оценивалась по коэффициенту Клейна, увеличившегося на 70% по сравнению с контролем. Также за время воздействия значительно увеличилось содержание диеновых и триеновых конъюгатов. Однако через 3 и через 24 ч после гипоксического воздействия достоверных отличий в коэф. Клейна и в уровне диеновых и триеновых конъюгатов не выявлено. Количество липоперекисей под влиянием гипобарической гипоксии также значительно увеличивается, но к 3 ч после воздействия наблюдается снижение на 30% по сравнению с контролем, а через сутки отмечено лишь незначительное увеличение на 10%. Изменение содержания ТБКАП имеет схожую динамику с липопе-рекисями, но 3-часовое снижение (на 60%) и увеличение (почти на 50%) через сутки более выражены. К концу гипоксического воздействия отмечено снижение одного из продуктов ПОЛ -оснований Шиффа на 30% по сравнению с контролем. К 3 ч после воздействия сохраняется незначительно пониженный уровень ОШ. Но через сутки после воздействия отмечено значительное увеличение ОШ (на 80% по отношению к контролю).
Неокортекс. В коре головного мозга, как и в гиппокампе, отмечено значительное увеличение коэффициента Клейна, а также количество диеновых, но не триеновых конъюгатов к концу гипоксического воздействия. В дальнейшем отличий от нормы в этих показателях не выявлено. Уровень липоперекисей после воздействия остается практически на контрольном уровне, но к 3 ч после воздействия увеличивается на 50%. К 1 сут уровень липоперекисей несколько выше контрольных значений. Содержание ТБКАП в не-окортексе к концу 3-часовой гипоксии снижается
ДИНАМИКА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ 200 г Гиппокамп
180
160
140
к 120
ч
о &
о 100 к
н
о
80 60 40 20 0
□ коэф. Клейна ■ ДК
□ ТК
□ лп
□ТБКАП
□ ОШ
Рис. 1. Динамика изменения содержания продуктов ПОЛ в гиппокампе сразу после (0), через 3 и 24 часа после гипо-ксического воздействия, где ДК - диеновые конъюганты, ТК - триеновые конъюганты, ЛП - липоперекиси, ТБКАП - тиобарбитуровой кислоты активные продукты, ОШ - основания Шиффа.
на 40%. Через 3 ч после воздействия уровень ТБКАП немного превышает контрольные значения, а через сутки он полностью нормализуется. Для оснований Шиффа достоверные отличия отмечены только в период восстановления через сутки (увеличение на 55% по отношению к контролю).
Обогащенная митохондриями фракция не-окортекса. Динамика изменений коэффициента Клейна, диеновых и триеновых конъюгатов ми-тохондриальной фракции совпадает с данными, полученными при исследовании гомогенатов не-окортекса. Для липоперекисей характерных изменений не выявлено. Их уровень несколько выше контрольного во все исследованные сроки. Особенностью митохондриальной фракции не-окортекса является резкое увеличение (на 70%) ТБКАП в течение гипоксического воздействия и быстрая нормализация уровня ТБКАП уже к 3 ч после воздействия. Изменен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.