НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 3, с. 249-253
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.158.97.616
ФЕРРИГЕМОГЛОБИН ИНДУЦИРУЕТ РИЛИЗИНГ NADPH ОКСИДАЗЫ ИЗ КЛЕТОК МОЗГОВОЙ ТКАНИ ex vivo: ПОДАВЛЕНИЕ ЭТОГО ПРОЦЕССА ГАЛАРМИНОМ
© 2013 г. Р. М. Симонян1, К. А. Галоян2, Г. М. Симонян1, А. Р. Хачатрян1, М. А. Бабаян1, *, Г. Р. Оксузян3, М. А. Симонян1
Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА, Республика Армения 2University ofMiami, Miller School of Medicine, Department of Orthopedics, Miami, Florida, USA
3ГПИ им. М. Налбандяна, Гюмри
На основании открытого недавно явления формирования нестабильного комплекса ферригемогло-бина (ферриЫЪ) с локализованной на клеточных мембранах NADPH оксидазой (Nox) был разработан простой, сравнительно нетрудоемкий, легко внедряемый и эффективный метод получения фракции Nox из мембран клеток мозговой ткани (МКМТ) крыс с использованием ионообменной хроматографии на целлюлозе DE-52. Впервые показано, что ферриЫЪ (до 2 х 10-6 М) стимулирует (до 2 раз) рилизинг Nox из МКМТ в растворимую фазу после 2 ч аэробной инкубации водной смеси этих мембран при 37°С и рН 8 ex vivo. Оптико-спектральные, кислотно-основные характеристики,
а также NADPH-зависимая O2 -продуцирующая и ферриЫЪ-восстанавливающая активности Nox
из МКМТ практически не отличаются от таковых для Nox из мембран других типов клеток (селезенка, эритроциты, костный мозг и т.д.). В этих условиях синтетический аналог нейроактивного богатого пролином полипептида (БПП-1) из нейросекреторных гранул гипоталамуса — галармин (до
10 мкг) нелинейным образом подавляет рилизинг Nox и стимулирует NADPH-зависимую O2 -продуцирующую и ферриЫЪ-восстанавливающую активности Nox. Можно заключить, что индуцирование рилизинга Nox из МКМТ ферригемоглобином является новым механизмом десатабилизации этих
мембран, а подавление галармином рилизинга Nox и стимуляция NADPH-зависимой O2 -продуцирующей и ферриЖ-восстанавливающей активностей этой Nox — новым механизмом стабилизации МКМТ, а также иммуномодуляции и регуляции кислородного гомеостаза в мозговой ткани.
Ключевые слова: клетки мозговой ткани, NADPH оксидаза, ферригемоглобин, рилизинг, галармин.
DOI: 10.7868/S102781331303014X
ВВЕДЕНИЕ
Изоформы NADPH оксидазы (Nox) играют ключевую роль в клеточных формированиях мозговой ткани при регуляции аэробных метаболических процессов с участием активных форм кислорода (АФК). При патологических состояниях различного характера наблюдается изменение
NADPH-зависимой O- -продуцирующей активности изоформ Nox) с нарушением физиологического равновесия между анти- и прооксидантны-ми системами. В результате этого наблюдается повышение уровня АФК, которые индуцируют оксидативное повреждение клеточных компонентов различного характера мозговой ткани,
* Адресат для корреспонденции: 0014, Ереван, ул. П. Севака, 5/1, +374 10-28-18-32, e-mail: mbabayan@biochem.sci.am.
включая мембраны этих клеток, для которых изоформы Nox (22 и 91 рИох) являются структурно-функциональными компонентами, локализованными на поверхностных формированиях этих мембран [1, 2]. Повышение активности №х может привести к развитию нейродегенеративных заболеваний. Так, под влиянием липополисаха-рида (ЛПС) наблюдается повышение суперок-сид-продуцирующей активности иммунными клетками мозговой ткани —микроглии с повышением уровня N0. При этом антиоксиданты ^-ацетилцистеин) и ингибиторы Nox (дифени-лениодониум) снижают повреждающее действие
эффектов супероксидных радикалов (О-) [3, 4]. Повышение активности №х в микроглиях индуцирует хронический оксидативныи стресс клеток гиппокампа и травматического повреждения
250
СИМОНЯН и др.
мозговой ткани, а ингибиторы Nox оказывают защитное действие [5, 6]. Nox вовлечены в глутати-он и цинк-индуцированную допаминергическую нейродегенерацию [7], при этом препарат налок-сон подавляет активность микроглии путем снижения уровня O- непосредственным воздействием на изоформу Nox (gp 91 phox) [8]. В результате активации мембранной изоформы Nox (gp 91 phox) при ишемии наблюдается индуцирование нейронального повреждения [9], а в активированных микроглиях Nox стимулирует ЛПС-инду-цированную нейротоксичность и экспрессию проинфламаторного гена [10]. Следовательно, в стратегии терапии приступа и нейродегенератив-ных заболеваний используются ингибиторы Nox [11, 12]. Эти результаты получены в большинстве с применением иммунофоретического Вестерн-блот метода при определении уровня Nox в клетках мозговой или других типов тканей [13]. Однако для установления новых механизмов стабилизации или дестабилизации нейрональных клеток необходимо разработать новый, более простой и сравнительно нетрудоемкий метод получения Nox из клеток мозговой ткани с учетом открытых недавно явлений высвобождения Nox из клеточных формирований и образования нестабильного комплекса между Nox и ферригемоглобином (ферриИЪ) [14, 15] в отсутствие и в присутствии синтетического аналога нейропептида из нейро-секреторных гранул гипоталамуса галармина (БПП-1). Установление этих механизмов — цель данной работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для выделения и очистки Nox (цитохрома b558) из клеток мозговой ткани использовали целлюлозу DE-52, ("Whatman", Англия) и сефадекс G-100 ("Pharmacia", Швеция). Синтетический аналог богатого пролином полипептида из нейросекре-торных гранул гипоталамуса галармин использовали для определения действия последнего на процесс рилизинга Nox из клеток мозговой ткани.
Для определения супероксид O-- продуцирующей активности Nox были использованы нит-ротетразолиевый синий (НТС), феназин мета-сульфат (ФМС), пирофосфат натрия, динатрие-вая или тетранатриевая соль NADPH фирмы "Sigma" (США), для восстановления Nox — кристаллы дитионита натрия (Sigma).
ФерриИЪ-восстанавливающую активность определяли с электрофоретически гомогенным препаратом ферриИЪ, полученным из цитозоля эритроцитов белых крыс.
Для проведения ионообменной хроматографии и гель-фильтрации были использованы стеклянные колонки со стеклянными фильтрами раз-
мером 2 х 10 см и 3 х 80 см соответственно. Электрофорез проводили на 10% полиакриламидном геле, на приборе венгерского производства. Были использованы центрифуги К-24 и K-70 ("VEB MLW Zentrifugenbaum Engelsdorf", Германия), а также термостат (Германия). Оптические спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Hitachi 2000 (Япония) с длиной оптического пути, равной 1 см.
Статистическая обработка полученных результатов была выполнена с предварительным анализом на нормальность (Шапиро—Уилк) распределения выборок. Межгрупповые различия определяли методом параметрического анализа ANOVA, а парные линейные контрасты — при помощи теста Шеффе. Непараметрический анализ для множественных выборок с ненормальным распределением выполнен при помощи теста Краскала—Уолиса. Ранговый тест Манна—Уитни использовали для выявления различий между парными выборками.
Выделение фракции изоформ Nox (цитохрома b558) из мембран клеток мозговой ткани. После взвешивания мозговой ткани (по 10 г) ее гомогенизировали в 100 мл 0.25 М сахарозе в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 2 мин при 4°С. Ядра клеток удаляли центрифугированием гомогената при 2000 об/мин в течение 10 мин. Митохондрии удаляли центрифугированием полученного надосадочного раствора при 12000 об/мин в течение 15 мин. Мембраны клеток мозговой ткани (МКМТ) осаждали центрифугированием полученного надосадочного раствора при 6000 об/мин при рН 5.6 в течение 20 мин. Далее осажденные МКМТ промывали водой (1 : 200 об/об) и повторно центрифугировали (10000 об/мин, 10 мин). Очищенные от следов сахарозы и других сопутствующих водорастворимых солей и белков МКМТ смешивали с водой (1 : 10 об/об) и повторно гомогенизировали в аналогичном режиме. Далее рН гомогената доводили до 8 разбавленной щелочью. Пробы гомогената (по 20 мл) инкубировали в аэробных условиях при 37°C в течение 2 ч ex vivo в отсутствие ферриНЬ или галармина (контрольная группа проб — K), в присутствии 2 х 10-6 М ферриНЬ (пробы опытной группы-1, ОГ-1) и в присутствии 2 х 10-6 М ферриНЬ +4 мкг галармина (ОГ-2), ферриНЬ и 8 мкг галармина (ОГ-3), ферриНЬ и 16 мкг галармина (ОГ-4).
Выделение и очистка Nox из проб ОГ-1-4. После центрифугирования приведенных проб при 14 000 об/мин в течение 15 мин супернатанты разбавляли водой в 25—30 раз и осуществляли ионообменную хроматографию на отдельных колонках с целлюлозой DE-52, уравновешенной 0.004 М калий фосфатным буфером (КФБ). Сопутствующие белковые фракции удаляли элюи-
рованием 0.02 М КФБ, а фракцию Nox из этой колонки элюировали 0.1 М КФБ.
Определение МАДРН-зависимой O2 -продуцирующей активности изоформ Nox. NAAPH-зависи-мую O2 -продуцирующую активность изоформ Nox определяли с помощью метода, использующего восстановление нитротетразолиевого синего (НТС), путем вычисления процента образующегося формазана при 560 нм в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За
единицу NAДPH-зaвиcимoй O- -продуцирующей активности Nox принимали количество белка (плотность оптического поглощения ß-полосы при 530 нм), стимулирующее образование формазана на 50%. Удельную NADPH-зависимую
O- -продуцирующую активность Nox определяли в расчете на 1 г мозговой ткани [16].
Определение ферриИЬ-восстанавливающей активности изоформ Nox. ФерриНЬ-восстанавлива-ющую активность изоформ Nox определяли, используя свежеполученный ферриНЬ из цитоплазмы эритроцитов крыс с величиной оптического поглощения (а-полоса поглощения) 0.8 оптических единиц (о.е.) при длине волны 565 нм (А565). Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 3 мл раствора ферриНЬ добавляли 0.2 мл Nox с ^530 = 0.3. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15—16 ч при 30°C. Далее после повторного перемешивания реакционной смеси определяли кинетику восстановления ферриНЬ до ферроНЬ путем измерения снижения плотности а-полосы поглощения ферриНЬ при 565 нм (что прямо пропорционально количеству образующегося ферроНЬ при ^555). За единицу фер-риНЬ-восстанавливающей активности NADPH оксидазы принимали количество белка, вызывающего сниж
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.